發(fā)布時(shí)間：2017-04-01 09:14

  本文關(guān)鍵詞：三種常見蜜蜂病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法的建立，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：蜜蜂是重要的授粉昆蟲,對整個(gè)自然生態(tài)系統(tǒng)有著不可取代的作用。蜜蜂黑蜂王臺病毒(black queen cell virus, BQCV)、蜜蜂殘翅病病毒(deformed wing virus, DWV)、蜜蜂囊狀幼蟲病毒(sacbrood virus, SBV)是常見并且對蜜蜂危害嚴(yán)重的蜜蜂病毒。常用的檢測方法有分子生物學(xué)、癥狀、免疫學(xué)等。但這些方法在儀器、技術(shù)等方面有特別的要求,實(shí)用性不強(qiáng)。因此針對BQCV、DWV、SBV建立一種快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、無需專用設(shè)備的實(shí)用性檢測方法是有必要的。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)在等溫條件下,僅需要一個(gè)水浴鍋在1h內(nèi)就可完成反應(yīng),通過熒光染料即可觀察結(jié)果,具有快捷、簡便的特點(diǎn)。本研究建立并優(yōu)化了BQCV-LAMP、DWV-LAMP、SBV-LAMP,驗(yàn)證特異性并與常規(guī)PCR技術(shù)對比驗(yàn)證敏感性,并分析其與PCR檢測臨床樣本的差異。主要研究結(jié)果：1)建立并優(yōu)化了BQCV-LAMP、DWV-LAMP、SBV-LAMP,優(yōu)化后的BQCV-LAMP體系外、內(nèi)引物比為1：3,甜菜堿濃度為0.8mmol/L, Mg2+濃度為2.0 mmol/L,在63℃條件下反應(yīng)45 min; SBV-LAMP體系外、內(nèi)引物比為1：2,甜菜堿濃度為0.6 mmol/L,Mg2+濃度為2.0 mmol/L,在63℃條件下反應(yīng)45 min；DWV-LAMP體系外、內(nèi)引物比為1：4,甜菜堿濃度為0.6 mmol/L, Mg2+;濃度為2.0 mmol/L,在63℃條件下反應(yīng)60 min。2) BQCV-LAMP、DWV-LAMP、SBV-LAMP均只有對BQCV、DWV、SBV出現(xiàn)多梯形條帶,特異性好。BQCV-LAMP的靈敏度可達(dá)86龜?shù)腞NA模板,常規(guī)PCR 8.6 pg的RNA模板,說明BQCV-LAMP的靈敏度比BQCV-PCR的要高100倍；SBV-LAMP的靈敏度可達(dá)93 fg的RNA模板,常規(guī)PCR 0.93 pg的RNA模板,說明SBV-LAMP的靈敏度比SBV-PCR的要高10倍；DWV-LAMP的靈敏度可達(dá)8.9 fg 的RNA模板,常規(guī)PCR 8.9 pg的RNA模板,說明DWV-LAMP的靈敏度比DWV-PCR的要高100倍.3)臨床檢測：用BQCV-LAMP方法檢測中華蜜蜂和意大利蜜蜂樣本各20份,其中陽性數(shù)量分別為5和15,陽性檢測率分別為25%和75%；PCR方法檢測同樣中華蜜蜂和意大利蜜蜂樣本,陽性數(shù)量分別為3和11,陽性檢測率分別為15%和55%。SBV-LAMP方法檢測20份中華蜜蜂樣本,陽性數(shù)量分別為12,陽性檢測率分別為60%；PCR檢測同樣20份中華蜜蜂樣本,陽性數(shù)量分別為9,陽性檢測率分別為45%。DWV-LAMP方法檢測20份意大利蜜蜂樣本,陽性數(shù)量分別為11,陽性檢測率分別為55%；DWV-PCR方法檢測同樣20份意大利蜜蜂樣本,陽性數(shù)量分別為7,陽性檢測率分別為35%。BQCV-LAMP、DWV-LAMP、SBV-LAMP三種檢測方法均比相應(yīng)的常規(guī)PCR方法檢測率高。
【關(guān)鍵詞】：黑蜂王臺病毒 囊狀幼蟲病毒 殘翅病毒 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 檢測
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S895
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 1 引言11-23
• 1.1 蜜蜂三種病毒研究進(jìn)展12-19
• 1.1.1 蜜蜂病害12-13
• 1.1.2 蜜蜂病毒的分類及其分子生物學(xué)13-15
• 1.1.3 蜜蜂三種病毒的危害和發(fā)病特征15-17
• 1.1.4 三種病毒的傳播17-19
• 1.1.5 三種病毒病的診斷方法19
• 1.2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)19-22
• 1.2.1 LAMP技術(shù)原理20-21
• 1.2.2 LAMP反應(yīng)特點(diǎn)21
• 1.2.3 LAMP的應(yīng)用21-22
• 1.3 本研究的目的和意義22-23
• 2 材料和方法23-34
• 2.1 材料23-26
• 2.1.1 供試材料23
• 2.1.2 主要試劑與配制23-25
• 2.1.3 主要儀器25-26
• 2.2 試驗(yàn)方法26-34
• 2.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成26-27
• 2.2.2 蜜蜂RNA提取及cDNA的合成27-28
• 2.2.3 LAMP檢測蜜蜂三種病毒方法的建立28-29
• 2.2.4 LAMP體系優(yōu)化29-31
• 2.2.5 擴(kuò)增區(qū)域的克隆測序31-34
• 2.2.6 敏感性和特異性試驗(yàn)驗(yàn)證34
• 2.2.7 臨床樣本的檢測34
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果34-56
• 3.1 應(yīng)用LAMP檢測BQCV的研究結(jié)果34-42
• 3.1.1 BQCV-LAMP反應(yīng)體系的優(yōu)化34-35
• 3.1.2 BQCV-LAMP外引物的PCR反應(yīng)與鑒定35-37
• 3.1.3 LAMP與PCR的敏感性對比試驗(yàn)37-38
• 3.1.4 可視化LAMP的特異性試驗(yàn)38-39
• 3.1.5 臨床樣本的檢測39-42
• 3.2 應(yīng)用LAMP檢測SBV的研究結(jié)果42-49
• 3.2.1 SBV-LAMP反應(yīng)體系的優(yōu)化42-44
• 3.2.2 SBV-LAMP外引物的PCR反應(yīng)與鑒定44-45
• 3.2.3 LAMP與PCR的敏感性對比試驗(yàn)45-46
• 3.2.4 可視化LAMP的特異性試驗(yàn)46-47
• 3.2.5 臨床樣本的檢測47-49
• 3.3 應(yīng)用LAMP檢測DWV的研究結(jié)果49-56
• 3.3.1 DWV-LAMP反應(yīng)體系的優(yōu)化49-51
• 3.3.2 DWV-LAMP外引物的PCR反應(yīng)與鑒定51-52
• 3.3.3 LAMP與PCR的敏感性對比試驗(yàn)52-53
• 3.3.4 可視化LAMP的特異性試驗(yàn)53-54
• 3.3.5 臨床樣本的檢測54-56
• 4 討論56-61
• 4.1 關(guān)于LAMP引物設(shè)計(jì)的討論56-57
• 4.2 關(guān)于LAMP體系優(yōu)化57-58
• 4.3 關(guān)于LAMP產(chǎn)物驗(yàn)證58
• 4.4 關(guān)于LAMP結(jié)果觀察58-59
• 4.5 BQCV-LAMP、SBV-LAMP、DWV-LAMP體系的優(yōu)勢59-60
• 4.6 本研究的展望60-61
• 參考文獻(xiàn)61-70
• 致謝70

【相似文獻(xiàn)】

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3 姚軍;周婷;王強(qiáng);;蜜蜂克什米爾病毒及其他病毒病檢測的研究進(jìn)展[A];中國養(yǎng)蜂學(xué)會蜜蜂保護(hù)專業(yè)委員會第九次學(xué)術(shù)研討會專輯[C];2003年

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本文編號：280376