本文關(guān)鍵詞：水稻兩個miRNA靶基因功能分析載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：稻瘟病作為水稻三大病害之一,是嚴(yán)重影響水稻生產(chǎn)的重要病害。目前研究表明,植物中的miRNA可以調(diào)控植物的生長發(fā)育,生物和非生物脅迫,以及抗性反應(yīng)。但是其中針對miRNA調(diào)節(jié)水稻和稻瘟病菌互作的研究報道很少,本實(shí)驗(yàn)室鑒定出了兩個正調(diào)稻瘟病抗性的miRNA:miRNA398和miRNA 160,并且他們可能是通過抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄來調(diào)控稻瘟病抗性。為了研究miRNA 160靶基因LOC_Os06g47150和miRNA398靶基因LOC_Os04g48410的生物學(xué)功能,驗(yàn)證靶基因LOC_Os06g47150與-niRNA160的關(guān)系、靶基因LOC_Os04g48410與miRNA398的關(guān)系,并進(jìn)一步闡釋miRNA398和miRNA 160的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究做準(zhǔn)備。本課題通過構(gòu)建niRNA160靶基因LOC_Os06g47150和miRNA398靶基因LOC_Os04g48410過表達(dá)載體,過表達(dá)突變載體,以及RNAi載體,并遺傳轉(zhuǎn)化水稻獲得了相應(yīng)材料。本研究中,首先是構(gòu)建miRNA 160靶基因LOC_Os06g47150和miRNA398靶基因LOC_Os04g48410過表達(dá)載體,通過注射本生煙觀察這兩個基因的亞細(xì)胞定位,發(fā)現(xiàn)靶基因LOC_Os04g48410主要在細(xì)胞膜上表達(dá),而靶基因LOC_Os06g47150主要在細(xì)胞核中表達(dá)。其次是構(gòu)建miRNA 160靶基因LOC_Os06g47150和miRNA398靶基因LOC_Os04g48410過表達(dá)突變載體,并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)化水稻,經(jīng)潮霉素鑒定和PCR鑒定后,LOC_Os06g47150mutant得到了4株轉(zhuǎn)基因水稻植株,LOC_Os04g48410 mutant得到24株轉(zhuǎn)基因水稻植株。最后構(gòu)建了miRNA 160靶基因LOC_Os06g47150和miRNA398靶基因LOC_Os04g48410 RNAi的載體。
【關(guān)鍵詞】：水稻 靶基因 突變體 RNAi 轉(zhuǎn)基因
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S511
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-8
• 符號說明8-9
• 1 文獻(xiàn)綜述9-25
• 1.1 植物的抗病性9-16
• 1.1.1 病原相關(guān)分子模式所激發(fā)的免疫反應(yīng)(PTI)10-11
• 1.1.2 效應(yīng)因子激發(fā)的免疫反應(yīng)(ETI)11-12
• 1.1.3 植物獲得性抗性(SAR)12-13
• 1.1.4 水稻中與稻瘟病相關(guān)的先天免疫反應(yīng)13-16
• 1.2 RNA干涉技術(shù)研究16-21
• 1.2.1 RNAi的作用機(jī)理17-19
• 1.2.2 RNAi的技術(shù)特點(diǎn)19-21
• 1.3 MicroRNA的研究進(jìn)展21-24
• 1.3.1 MicroRNA的發(fā)現(xiàn)21
• 1.3.2 MicroRNA的合成21-23
• 1.3.3 MicroRNA的作用機(jī)制23
• 1.3.4 MicroRNA在植物中的作用23-24
• 1.4 論文選題依據(jù)及研究的目的意義24-25
• 2 材料與方法25-36
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料25-27
• 2.1.1 水稻材料25
• 2.1.2 遺傳轉(zhuǎn)化體系中菌株和質(zhì)粒載體25
• 2.1.3 分子生物學(xué)試劑25-26
• 2.1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備26
• 2.1.5 培養(yǎng)基及其抗生素26-27
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法27-36
• 2.2.1 水稻材料培養(yǎng)27
• 2.2.2 水稻DNA提取27
• 2.2.3 水稻總RNA提取,反轉(zhuǎn)為cDNA27-29
• 2.2.3.1 水稻總RNA提取的準(zhǔn)備27
• 2.2.3.2 水稻總RNA提取步驟27-28
• 2.2.3.3 RNA純化及反轉(zhuǎn)錄28-29
• 2.2.4 相關(guān)克隆載體的構(gòu)建29-33
• 2.2.4.1 目標(biāo)基因的克隆及回收純化29-30
• 2.2.4.2 大腸桿菌感受態(tài)的制備30
• 2.2.4.3 大腸桿菌的轉(zhuǎn)化30-32
• 2.2.4.4 農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備32
• 2.2.4.5 農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化(電轉(zhuǎn))32
• 2.2.4.6 農(nóng)桿菌的菌落PCR檢測32-33
• 2.2.5 本生煙瞬時表達(dá)33
• 2.2.6 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化33-35
• 2.2.6.1 主要涉及的培養(yǎng)基33-34
• 2.2.6.2 水稻愈傷組織的誘導(dǎo)34
• 2.2.6.3 轉(zhuǎn)化愈傷組織34-35
• 2.2.7 對遺傳轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的水稻植株進(jìn)行陽性鑒定35-36
• 2.2.7.1 潮霉素初篩35
• 2.2.7.2 水稻轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)行PCR鑒定35-36
• 3 結(jié)果與分析36-45
• 3.1 miRNA160靶基因LOC_Os06g47150和miRNA398靶基因LOC_Os04g48410過表達(dá)載體的構(gòu)建及亞細(xì)胞定位37-40
• 3.1.1 載體構(gòu)建37-38
• 3.1.2 亞細(xì)胞定位38-40
• 3.2 miRNA160靶基因LOC_Os06g47150和miRNA398靶基因LOC_Os04g48410過表達(dá)突變體載體的構(gòu)建40-41
• 3.3 miRNA160靶基因LOC_Os06g47150和miRNA398靶基因LOC_Os04g48410RNAi載體的構(gòu)建41-42
• 3.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化42-45
• 3.4.1 轉(zhuǎn)化42-43
• 3.4.2 鑒定43-45
• 4 討論45-47
• 參考文獻(xiàn)47-55
• 致謝55-56
• 附錄56-59
• 附表1.引物59-60

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本文編號：278790