發(fā)布時(shí)間：2020-07-30 03:10

【摘要】：目的：枝孢樣枝孢霉是一種廣泛存在于環(huán)境中的暗色真菌,伴隨著人類(lèi)免疫抑制病增多,枝孢樣枝孢霉感染人和動(dòng)物的病例都有所增加,也是真菌過(guò)敏癥的重要病原菌之一。目前,對(duì)枝孢樣枝孢霉致病機(jī)理研究較少,對(duì)枝孢樣枝孢霉引起的暗色絲孢霉病的診治效果較差。本研究將利用微波、NTG復(fù)合誘變選育枝孢樣枝孢霉弱毒突變株,利用SSH進(jìn)一步篩選野生型和突變型的差異表達(dá)基因,以探究枝孢樣枝孢霉的分子致病機(jī)制,為其引起的大熊貓及人皮膚病的診斷、治療提供依據(jù),為枝孢樣枝孢霉的后續(xù)研究提供參考。方法：本試驗(yàn)采用大熊貓?jiān)粗︽邩又︽呙篂槌霭l(fā)菌株,用不同濃度的NTG和微波誘變,獲得表型和致病力都發(fā)生明顯變化的突變株,進(jìn)而采用抑制性消減雜交技術(shù)構(gòu)建大熊貓?jiān)粗︽邩又︽呙共町惐磉_(dá)基因的消減cDNA文庫(kù),獲得其差異表達(dá)基因片段,進(jìn)行序列測(cè)定以及生物信息學(xué)分析。結(jié)果：1.確定了枝孢樣枝孢霉最佳的復(fù)合誘變條件為微波60s+2mg/mL NTG 30min;通過(guò)誘變篩選得到一株菌落顏色明顯變淺、產(chǎn)孢量少,產(chǎn)孢速度慢、易衰老的菌株(Zt)；對(duì)野生型和突變型菌株進(jìn)行小鼠致病性試驗(yàn)和感染率測(cè)定,結(jié)果表明野生株(Z20)與突變株(Zt)對(duì)小鼠皮膚都有侵染機(jī)會(huì),野生株對(duì)小鼠感染率高達(dá)97.5%,突變株對(duì)小鼠感染率為42.5%。2.提取上述枝孢樣枝孢霉野生型和突變型的總RNA,并分離出其mRNA,利用SSH建立了野生型與突變型的差異表達(dá)cDNA文庫(kù)。經(jīng)過(guò)篩選、序列測(cè)定獲得野生型特異片段5個(gè),突變型特異片段2個(gè)。3.將上述序列在Genebank進(jìn)行BLAST同源比對(duì),比對(duì)結(jié)果如下：a.生化代謝類(lèi)：FH1-3與細(xì)胞色素氧化酶亞單位Ⅰ高度同源,與線粒體基因高度同源,FH1-4和FH1-5與假設(shè)蛋白有一定同源,與線粒體基因高度同源。b.細(xì)胞結(jié)構(gòu)類(lèi)：FH1-1與金屬羧肽酶抑制劑、細(xì)胞壁水解酶、脂蛋白有一定同源,FH2-1與脂肪酶有一定同源性；c.其他類(lèi)：FH1-2與第一類(lèi)整合子DfrA17基因有一定同源,與白喉毒素抑制因子基因有一定同源性,與細(xì)胞毒素蛋白也有一定同源性。將7條序列在ORF finder、 Predictprotein和Omiga2.0進(jìn)行分析,所得序列都含有可能的ORF,以及不同數(shù)量、不同位點(diǎn)的真菌基序,提示這些差異序列都是枝孢樣枝孢霉菌株內(nèi)編碼蛋白質(zhì)的基因片段。結(jié)論：確定了致枝孢樣枝孢霉突變的誘變條件,獲得了其表型改變、致病力減弱的突變株(Zt)。利用抑制消減雜交技術(shù)成功建立了枝孢樣枝孢霉野生型和突變型的差異cDNA文庫(kù),篩選出野生型和突變型差異表達(dá)基因片段,分別與細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生化代謝及毒素相關(guān)蛋白同源,說(shuō)明這些片段可能為枝孢樣枝孢霉野生型和突變型相關(guān)分化、代謝、毒素蛋白的部分片段,并可能包含與枝孢樣枝孢霉有關(guān)的毒力因子,為研究枝孢樣枝孢霉分子致病機(jī)制提供了重要信息。
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S852.66

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本文編號(hào)：2774919