【摘要】：目的：枝孢樣枝孢霉是一種廣泛存在于環(huán)境中的暗色真菌,伴隨著人類免疫抑制病增多,枝孢樣枝孢霉感染人和動物的病例都有所增加,也是真菌過敏癥的重要病原菌之一。目前,對枝孢樣枝孢霉致病機理研究較少,對枝孢樣枝孢霉引起的暗色絲孢霉病的診治效果較差。本研究將利用微波、NTG復合誘變選育枝孢樣枝孢霉弱毒突變株,利用SSH進一步篩選野生型和突變型的差異表達基因,以探究枝孢樣枝孢霉的分子致病機制,為其引起的大熊貓及人皮膚病的診斷、治療提供依據,為枝孢樣枝孢霉的后續(xù)研究提供參考。方法：本試驗采用大熊貓源枝孢樣枝孢霉為出發(fā)菌株,用不同濃度的NTG和微波誘變,獲得表型和致病力都發(fā)生明顯變化的突變株,進而采用抑制性消減雜交技術構建大熊貓源枝孢樣枝孢霉差異表達基因的消減cDNA文庫,獲得其差異表達基因片段,進行序列測定以及生物信息學分析。結果：1.確定了枝孢樣枝孢霉最佳的復合誘變條件為微波60s+2mg/mL NTG 30min;通過誘變篩選得到一株菌落顏色明顯變淺、產孢量少,產孢速度慢、易衰老的菌株(Zt)；對野生型和突變型菌株進行小鼠致病性試驗和感染率測定,結果表明野生株(Z20)與突變株(Zt)對小鼠皮膚都有侵染機會,野生株對小鼠感染率高達97.5%,突變株對小鼠感染率為42.5%。2.提取上述枝孢樣枝孢霉野生型和突變型的總RNA,并分離出其mRNA,利用SSH建立了野生型與突變型的差異表達cDNA文庫。經過篩選、序列測定獲得野生型特異片段5個,突變型特異片段2個。3.將上述序列在Genebank進行BLAST同源比對,比對結果如下：a.生化代謝類：FH1-3與細胞色素氧化酶亞單位Ⅰ高度同源,與線粒體基因高度同源,FH1-4和FH1-5與假設蛋白有一定同源,與線粒體基因高度同源。b.細胞結構類：FH1-1與金屬羧肽酶抑制劑、細胞壁水解酶、脂蛋白有一定同源,FH2-1與脂肪酶有一定同源性；c.其他類：FH1-2與第一類整合子DfrA17基因有一定同源,與白喉毒素抑制因子基因有一定同源性,與細胞毒素蛋白也有一定同源性。將7條序列在ORF finder、 Predictprotein和Omiga2.0進行分析,所得序列都含有可能的ORF,以及不同數量、不同位點的真菌基序,提示這些差異序列都是枝孢樣枝孢霉菌株內編碼蛋白質的基因片段。結論：確定了致枝孢樣枝孢霉突變的誘變條件,獲得了其表型改變、致病力減弱的突變株(Zt)。利用抑制消減雜交技術成功建立了枝孢樣枝孢霉野生型和突變型的差異cDNA文庫,篩選出野生型和突變型差異表達基因片段,分別與細胞結構、生化代謝及毒素相關蛋白同源,說明這些片段可能為枝孢樣枝孢霉野生型和突變型相關分化、代謝、毒素蛋白的部分片段,并可能包含與枝孢樣枝孢霉有關的毒力因子,為研究枝孢樣枝孢霉分子致病機制提供了重要信息。
【學位授予單位】：四川農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.66

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本文編號：2774919