【摘要】：志賀菌是腸道致病菌,感染后可以引起成年人和兒童腹瀉。以前人們一直認為志賀菌不能使畜禽致病,實際上,大量國內(nèi)外相關(guān)報道顯示志賀菌可以感染多種動物,例如豬、狐貍、獼猴、牛、雞、鴨等,感染后可引起腹瀉、腹痛嚴重者甚至導致死亡。近年來發(fā)現(xiàn)的雞志賀菌病是一種急性傳染病,可以引起不同日齡和不同品種的雞發(fā)生腹瀉,具有十分廣泛的流行性,不僅嚴重危害養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展,而且給養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大經(jīng)濟的損失。因為志賀菌在人和多種動物之間可能存在十分廣泛的交叉感染,這嚴重危害了人類公共衛(wèi)生和獸醫(yī)公共衛(wèi)生。志賀菌侵襲腸上皮細胞是志賀菌致病的關(guān)鍵。大量研究顯示,志賀菌侵襲腸道過程中毒力大質(zhì)粒上Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌的IpaC蛋白通過介導細胞骨架重排而使志賀菌趁機侵入腸上皮細胞,而且只有重組純化的IpaC蛋白才能夠在一定程度上恢復志賀菌的侵襲能力。在分子水平上,IpaC蛋白不同結(jié)構(gòu)域具有不同生物學功能,IpaC蛋白N端的20個氨基酸與Ⅲ型分泌系統(tǒng)有關(guān),中央疏水區(qū)兩個橫跨膜的螺旋線與磷脂膜滲透及蛋白質(zhì)的穩(wěn)定有關(guān),而IpaC蛋白C端則與觸發(fā)肌動蛋白有關(guān)。雞源志賀菌與人源志賀菌分泌的IpaC蛋白分子相同,分析其分子進化特性發(fā)現(xiàn),這兩種不同物種來源的志賀菌IpaC蛋白進化起源相同。因此,通過酵母表達系統(tǒng)表達雞源志賀菌IpaC蛋白,保持IpaC蛋白的天然構(gòu)象具有十分重要的意義。本研究分別以雞源志賀菌IpaC基因原序列及根據(jù)酵母偏愛性密碼子優(yōu)化合成的IpaC*基因為研究對象,分別構(gòu)建真核表達載體pGAPZαA-IpaC和pGAPZαA-IpaC*,轉(zhuǎn)化至酵母宿主菌X-33中成功實現(xiàn)了雞源志賀菌IpaC*基因在畢赤酵母中的胞內(nèi)表達。研究結(jié)果如下:1.根據(jù)真核表達載體pGAPZαA多克隆位點及雞源志賀菌IpaC基因序列設(shè)計一對引物,以本實驗室保存重組載體pET32a-IpaC為模板,利用PCR技術(shù)擴增得到雞源志賀菌IpaC基因,與真核表達載體pGAPZαA同時雙酶切,然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TOP10中,經(jīng)菌液PCR、質(zhì)粒雙酶切及測序鑒定,成功構(gòu)建真核表達載體pGAPZαA-IpaC。2.真核表達載體pGAPZαA-IpaC經(jīng)單酶切線性化后,電擊法轉(zhuǎn)化至酵母宿主菌X-33中,挑取高抗性(Zeocin濃度為2000 ug/mL)YPD固體培養(yǎng)基的陽性克隆擴大培養(yǎng),經(jīng)酵母基因組PCR擴增及序列測定鑒定正確后,挑取鑒定正確的重組酵母pGAPZαA-IpaC/X-33轉(zhuǎn)接至YPD液體培養(yǎng)基中表達,分別在不同時間點定時取樣,SDS-PAGE電泳及Western blot檢測,結(jié)果顯示,雞源志賀菌IpaC基因原序列在重組酵母X-33胞內(nèi)和胞外均未表達。3.在不改變IpaC蛋白氨基酸序列的情況下根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性優(yōu)化合成雞源志賀菌IpaC*基因,將其克隆至酵母表達載體pGAPZαA中,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TOP10中,挑取鑒定正確的重組質(zhì)粒pGAPZαA-IpaC*轉(zhuǎn)化至酵母宿主菌X-33中,經(jīng)高抗篩選、PCR擴增及序列測定鑒定正確。挑取鑒定正確的克隆菌株轉(zhuǎn)接于YPD液體培養(yǎng)基中,不同時間點取樣,經(jīng)SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示,經(jīng)超濾濃縮后培養(yǎng)基上清中無明顯條帶,菌體沉淀在70 kDa有條帶。用表達產(chǎn)物分別與IpaC蛋白的免疫抗體血清、雞源志賀菌菌體滅活疫苗免疫抗體血清和His標簽抗體做Western blot檢測,均在70 kDa處有特異性條帶,表明優(yōu)化合成的IpaC*基因在酵母中成功表達,說明酵母表達系統(tǒng)表達外源蛋白水平與外源基因本身有關(guān)。本研究中表達的重組目的蛋白大小約為70 kDa,在108h表達量達到最大,為酵母胞內(nèi)表達。
【學位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.61

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本文編號：2742028