本文關(guān)鍵詞：稻瘟病菌脅迫下水稻熱激蛋白質(zhì)與異三聚體G蛋白質(zhì)的作用機理研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：水稻稻瘟病由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)侵染引起,是水稻最嚴重的病害之一,可造成水稻的大幅度減產(chǎn),甚至顆粒無收。水稻稻瘟病分布十分廣泛,世界各地均有發(fā)生,我國作為重要的水稻產(chǎn)區(qū),也深受其害。探明水稻對稻瘟病菌侵染的感知、傳導與響應的分子機制,指導培育出抗稻瘟病的水稻新品種,是避免水稻因稻瘟病而大幅減產(chǎn)的重要研究內(nèi)容。前人研究表明,熱激蛋白質(zhì)(Heat shock protein, Hsp)與異三聚體G蛋白質(zhì)(Heterotrimeric G-protein)是生物體內(nèi)信號傳導通路的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。但目前對異三聚體G蛋白質(zhì)和Hsp在水稻應對稻瘟病菌脅迫中的作用機制研究尚不多見。本文以水稻品種日本晴(Nipponbare)為試驗材料,首先應用生物信息學方法、2-DE、質(zhì)譜技術(shù)、基因芯片分析技術(shù)以及qRT-PCR技術(shù)分析稻瘟病菌生理小種GUY 11侵染脅迫后2d、4d和6d下水稻葉片異三聚體G蛋白質(zhì)和熱激蛋白質(zhì)的表達差異；然后,通過1DNative-PAGE、2D SDS-PAGE和Pull-down等技術(shù),分析稻瘟病菌脅迫下與水稻的互作蛋白質(zhì),結(jié)果如下。1、從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取前人已克隆的稻瘟病菌抗性基因序列,通過BLAST和BWA軟件查找各抗性基因在日本晴基因組的位置及其SNP位點,發(fā)現(xiàn)與GUY11感病的水稻品種C039相比,在日本晴基因組中定位到Pish, Pi-d3, Pi-56, Pi-21和Pi-37抗性基因位點及SNP。2、應用2-DE技術(shù)和MALDI-TOF-TOF-MS質(zhì)譜技術(shù)分析稻瘟菌侵染2d、4d和6d下水稻葉片蛋白質(zhì)的表達差異。鑒定出了22個差異表達的蛋白質(zhì),其中17個蛋白質(zhì)的表達量在三個脅迫時期均上調(diào),其他5個蛋白質(zhì)的表達量在3個脅迫時期均下調(diào)。根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果和GO分析結(jié)果,這22個差異蛋白質(zhì)可分為抗逆相關(guān)蛋白質(zhì)、光合作用相關(guān)蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)合成相關(guān)蛋白質(zhì)三類。其中,在抗逆相關(guān)蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了6個熱激蛋白質(zhì),分別是Hsp90、 Hsp70、Cpn60、Hsp17.9A、Hsp17.4和Hsp16.9A,均為上調(diào)表達,表明熱激蛋白質(zhì)在水稻應對稻瘟病菌脅迫中具有重要作用。3、從NCBI數(shù)據(jù)庫下載獲得水稻在稻瘟病菌生理小種GUY11脅迫48h下的基因芯片表達譜數(shù)據(jù)(GSE9450),應用工具GEO2R分析基因的差異表達。發(fā)現(xiàn)其中有4個差異表達的基因與上述差異表達蛋白質(zhì)相匹配,且在抗病水稻品種中的表達量高于感病品種。其中,有兩個蛋白質(zhì)是熱激蛋白,分別是Hsp17.9A和Cpn60,表明熱激蛋白表達量的高低可能與不同水稻品種的不同抗稻瘟能力有關(guān)。4、qRT-PCR的結(jié)果發(fā)現(xiàn),G蛋白各亞基在稻瘟病菌侵染下的表達量大多受到抑制,但是在不同的時間點,總有不同的G蛋白亞基表達量不再呈現(xiàn)下調(diào)。結(jié)果表明,盡管稻瘟病菌能抑制G蛋白各亞基的表達,但是水稻可能在稻瘟病菌的抑制下仍能通過調(diào)控不同的G蛋白亞基的表達來向下游通路傳遞脅迫信號。5、Native-PAGE發(fā)現(xiàn)了3個蛋白質(zhì)復合體,包含4個能量代謝相關(guān)蛋白質(zhì)和2個抗逆脅迫相關(guān)蛋白,并通過GO分析推測這些蛋白質(zhì)體內(nèi)互作的可能。His Pull-down結(jié)果檢測出了5個可能與Hsp17.9A蛋白互作的蛋白質(zhì)。推測在稻瘟病菌脅迫下,Hsp17.9A表達量上調(diào),并通過蛋白質(zhì)互作將脅迫信號傳遞給下游互作蛋白,調(diào)控水稻體內(nèi)的氨基酸代謝、碳代謝、蛋白質(zhì)合成與病原菌防御過程,以應對稻瘟菌的脅迫。本文研究結(jié)果揭示了在稻瘟菌脅迫下水稻熱激蛋白質(zhì)和異三聚體G蛋白的作用機制,尤其是從蛋白質(zhì)表達、基因表達和蛋白質(zhì)互作的角度,闡明了Hsp17.9A在應對稻瘟病菌脅迫下的作用方式。這些研究結(jié)果與本實驗室前期對非生物脅迫下熱激蛋白質(zhì)的作用機制研究結(jié)果相一致,為下一步應用突變體技術(shù)深入開展Hsp17.9A的功能研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：水稻 稻瘟病菌 熱激蛋白質(zhì) 異三聚體G蛋白質(zhì) 作用機理
【學位授予單位】：福建農(nóng)林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S435.111.41
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 1 引言11-22
• 1.1 熱激蛋白質(zhì)12-15
• 1.1.1 熱激蛋白質(zhì)概述12-13
• 1.1.2 水稻熱激蛋白質(zhì)研究進展13-15
• 1.2 異三聚體G蛋白質(zhì)15-17
• 1.2.1 異三聚體G蛋白質(zhì)概述15
• 1.2.2 植物中的G蛋白質(zhì)研究進展15-16
• 1.2.3 水稻異三聚體G蛋白質(zhì)研究進展16-17
• 1.3 蛋白質(zhì)相互作用研究概況17-21
• 1.3.1 免疫共沉淀18
• 1.3.2 蛋白質(zhì)親和層析18
• 1.3.3 酵母雙雜交18-19
• 1.3.4 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳19
• 1.3.5 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)19-20
• 1.3.6 Pull-down技術(shù)20-21
• 1.3.7 Far-Western blotting技術(shù)21
• 1.3.8 雙分子熒光互補技術(shù)21
• 1.4 本課題研究思路21-22
• 2 材料與方法22-34
• 2.1 材料22
• 2.2 材料處理22-23
• 2.3 稻瘟病主效抗性基因序列差異分析23
• 2.4 稻瘟病菌脅迫下水稻葉片差異表達蛋白質(zhì)分析23-27
• 2.4.1 雙向電泳分析23-26
• 2.4.2 差異蛋白質(zhì)表達圖譜的建立及差異點的鑒定26
• 2.4.3 凝膠蛋白質(zhì)點的酶解26
• 2.4.4 MALDI-TOF/MS和MALDI-TOF/TOF/MS26
• 2.4.5 Gene Ontology(Go)分析26-27
• 2.4.6 共表達網(wǎng)絡構(gòu)建及功能模塊鑒定27
• 2.5 稻瘟病菌脅迫下水稻葉片差異表達基因分析27-28
• 2.5.1 基因芯片數(shù)據(jù)的獲取與分析27
• 2.5.2 Real time qPCR27-28
• 2.6 稻瘟病菌脅迫下水稻葉片互作蛋白質(zhì)分析28-34
• 2.6.1 非變性凝膠的雙向電泳28-29
• 2.6.2 Pull down分析29-34
• 3 結(jié)果與分析34-53
• 3.1 稻瘟病菌侵染下水稻的發(fā)病癥狀34
• 3.2 日本晴水稻應對稻瘟病菌脅迫的主效抗性基因分析34-35
• 3.3 稻瘟病菌侵染脅迫下日本晴水稻葉片差異表達蛋白質(zhì)的鑒定與分析35-43
• 3.4 日本晴水稻應對稻瘟病菌脅迫的蛋白質(zhì)共表達分析43
• 3.5 稻瘟病菌脅迫下水稻基因的差異表達43-44
• 3.6 Real time qPCR對G蛋白質(zhì)的差異表達分析44-45
• 3.7 稻瘟病菌侵染脅迫下日本晴水稻葉片互作蛋白質(zhì)分析45-53
• 3.7.1 1-D Native-PAGE/2-D SDS-PAGE分離45-50
• 3.7.2 His Pull-down分析50-53
• 4 討論53-58
• 4.1 日本晴水稻應對稻瘟病菌脅迫的主效抗性基因分析53-54
• 4.2 稻瘟病菌侵染脅迫下日本晴水稻葉片差異表達蛋白質(zhì)54-56
• 4.2.1 抗逆脅迫相關(guān)蛋白質(zhì)54-55
• 4.2.2 光合作用相關(guān)蛋白質(zhì)55-56
• 4.2.3 蛋白質(zhì)合成相關(guān)蛋白質(zhì)56
• 4.2.4 小結(jié)56
• 4.3 稻瘟病菌侵染脅迫下日本晴水稻葉片差異表達基因56-57
• 4.4 稻瘟病菌侵染脅迫下日本晴水稻葉片互作蛋白質(zhì)分析57-58
• 5 小結(jié)58-60
• 參考文獻60-69
• 致謝69

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