發(fā)布時(shí)間：2017-03-24 14:03

  本文關(guān)鍵詞：白斑綜合征病毒（WSSV）膠體金免疫半定量快速檢測試紙條的研制與應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：白斑綜合征病毒(WSSV)是在全世界范圍內(nèi)為蝦類養(yǎng)殖業(yè)帶來損失最大的病毒之一,且目前尚缺乏有效的治療措施,因此在WSSV感染的早期,能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)WSSV快速、定量檢測,為預(yù)防控制該病的暴發(fā)、預(yù)警預(yù)報(bào)和減少經(jīng)濟(jì)損失具有重要意義。針對(duì)WSSV定量檢測目前常采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、實(shí)時(shí)定量PCR、雙抗體夾心ELISA等方法,但是現(xiàn)有的這些檢測方法在實(shí)際應(yīng)用中皆在不同程度上受到花費(fèi)高、耗時(shí)長、需要專業(yè)儀器等方面的限制,針對(duì)上述情況,本實(shí)驗(yàn)研制了一種WSSV膠體金免疫層析半定量快速檢測試紙,其檢測結(jié)果肉眼可見,不需要專業(yè)儀器設(shè)備,整個(gè)過程僅需要10min,適用于養(yǎng)殖現(xiàn)場的蝦類、蟹類等甲殼類中WSSV的半定量快速檢測。本實(shí)驗(yàn)具體如下所述,復(fù)蘇WSSV單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞2E6、1G12、3B7、4G9和5D2,利用辛酸-硫酸銨法純化腹水單抗。選擇單抗2E6作為金標(biāo)抗體,以檸檬酸鈉還原法制備膠體金,通過膠體金標(biāo)記單抗2E6制備金標(biāo)抗體,使用噴膜儀將制備的金標(biāo)單抗2E6液體均勻噴涂到玻璃纖維上,即為金標(biāo)墊,分別將不同濃度的單抗4G9包被于硝酸纖維素膜(NC膜)分別作為檢測線T1,檢測線T2和檢測線T3,將羊抗小鼠IgG包被于硝酸纖維素膜(NC膜),作為質(zhì)控線。并組裝金標(biāo)墊、NC膜與樣品墊、吸收墊和塑料底板制成WSSV膠體金免疫層析半定量快速檢測試紙。另外對(duì)其進(jìn)行了優(yōu)化,選擇Whatman AE99作為WSSV檢測試紙條的NC膜,單抗1G12、3B7、4G9、5D2按4：2：2：1的比例混合作為試紙條檢測線抗體,優(yōu)化后的試紙條的最低檢測限為783ng/ml。使用WSSV膠體金免疫層析半定量快速檢測試紙檢測樣品,若檢測線T1、T2、T3和質(zhì)控線都呈現(xiàn)紅色時(shí),說明WSSV蛋白濃度大于6.26μg/ml;若檢測線T1、T2和質(zhì)控線顯現(xiàn)紅色時(shí),說明WSSV蛋白濃度位于3.13μg/ml-6.26μg/ml之間；若只有檢測線T1和質(zhì)控線顯現(xiàn)紅色時(shí),說明WSSV蛋白濃度位于783ng/ml～3.13u g/ml;若只有質(zhì)控線顯現(xiàn)紅色時(shí),表明WSSV蛋白濃度小于783ng/ml,或者不含WSSV。建立了白斑綜合征病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),分別利用制備的WSSV膠體金免疫層析半定量快速檢測試紙和建立的WSSV實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),跟蹤檢測了感染W(wǎng)SSV后克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)組織內(nèi)病毒濃度的動(dòng)態(tài)變化。注射WSSV粗提液感染克氏原螯蝦,在感染后0h、3h、6h、12h、24h、36h、48h、60h和72h分別取螯蝦鰓、血淋巴、心臟、附肢、造血組織和肌肉,提取各組織DNA,實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定WSSV濃度,結(jié)果顯示,WSSV感染后3h在附肢、鰓、血淋巴和造血組織中檢測到病毒,12h時(shí)在各樣品組織中皆檢測到病毒,但濃度較低；24-48h內(nèi)WSSV濃度呈指數(shù)增長,此時(shí)螯蝦出現(xiàn)少量死亡：60-72h內(nèi)各組織中WSSV數(shù)量達(dá)到緩慢增長的平臺(tái)期,螯蝦累計(jì)死亡率快速增高。螫蝦體內(nèi)WSSV濃度與螯蝦死亡率呈密切的正相關(guān)關(guān)系,其中附肢中WSSV動(dòng)態(tài)變化趨勢能夠較好的代表多數(shù)樣品組織中的WSSV增殖規(guī)律,因此在實(shí)驗(yàn)室及養(yǎng)殖場WSSV檢測中可將附肢作為首選的檢測組織。在感染W(wǎng)SSV后不同時(shí)間點(diǎn)WSSV在各組織中的分布也有很大差異,分析各組織中WSSV分布的差異,推測WSSV最先在血淋巴中大量復(fù)制,隨后由于血淋巴循環(huán)造成對(duì)其它組織的感染。使用WSSV膠體金免疫層析半定量快速檢測試紙檢測血淋巴、鰓中不用時(shí)間點(diǎn)WSSV濃度,結(jié)果顯示試紙條所測樣品結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果一致率為100%。因而,WSSV膠體金免疫層析半定量快速檢測試紙是一種快速、準(zhǔn)確、適合于養(yǎng)殖現(xiàn)場使用的WSSV半定量檢測方法。
【關(guān)鍵詞】：白斑綜合征病毒(WSSV) 膠體金免疫層析半定量快速檢測試紙 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 病毒增殖 克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)
【學(xué)位授予單位】：中國海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S945.4
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 1 前言11-25
• 1.1 白斑綜合征病毒概述11-16
• 1.2 白斑綜合征病毒檢測方法16-20
• 1.3 膠體金免疫層析試紙條研究進(jìn)展20-25
• 2. 白斑綜合征病毒(WSSV)膠體金免疫層析半定量快速檢測試紙條的研制25-49
• 2.1 膠體金標(biāo)記WSSV單克隆抗體的制備25-29
• 2.2 白斑綜合征病毒(WSSV)膠體金免疫層析半定量快速檢測試紙條的制作29-36
• 2.3 白斑綜合征病毒膠體金免疫層析半定量快速檢測試紙條的優(yōu)化36-43
• 2.4 白斑綜合征病毒膠體金免疫層析半定量快速檢測試紙條定量范圍、特異性、重復(fù)性與穩(wěn)定性的檢測43-49
• 3 白斑綜合征病毒(WSSV)膠體金免疫層析半定量快速檢測試紙條的應(yīng)用49-60
• 3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測人工感染白斑綜合征病毒克氏原螯蝦體內(nèi)白斑綜合征病毒動(dòng)態(tài)變化49-56
• 3.2 使用白斑綜合征病毒膠體金免疫層析半定量快速檢測試紙條檢測人工感染白斑綜合征病毒克氏原螯蝦體病毒動(dòng)態(tài)變化56-60
• 參考文獻(xiàn)60-68
• 致謝68-69
• 個(gè)人簡歷69
• 碩士期間發(fā)表文章69

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