本文關(guān)鍵詞：鴨疫里默氏桿菌hemophore的發(fā)現(xiàn)及作為抗菌靶點(diǎn)的探索，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：細(xì)菌鐵和血紅素(heme)的利用是當(dāng)前抗菌研究的熱點(diǎn)。本研究針對(duì)鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer, RA)血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)并鑒定了一種胞外的heme綁定蛋白hemophore。隨后,通過生物信息學(xué)分析查找到了一個(gè)潛在編碼hemophore蛋白的基因家族,我們選取其中一條基因并對(duì)其進(jìn)行了克隆、原核表達(dá)、純化及功能鑒定。最后,為達(dá)到抗菌目的,我們根據(jù)hemophore具有靶向轉(zhuǎn)運(yùn)heme的特點(diǎn),找到了一種類似heme的藥物SDNS (C32H22N6Na2O6S2),并初步探索了其在抗RA中的作用。本文主要試驗(yàn)結(jié)果如下：1鴨疫里默氏桿菌胞外heme綁定蛋白hemophore的發(fā)現(xiàn)及鑒定由于細(xì)菌血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)蛋白的表達(dá)受環(huán)境中鐵離子或血紅素濃度的調(diào)節(jié),我們試圖通過在鐵離子限制性液體培養(yǎng)基或含血紅素的液體培養(yǎng)基中提取RA的分泌蛋白,并鑒定其中是否含有heme綁定蛋白。結(jié)果我們在含血紅素的LB液體培養(yǎng)基中通過TCA沉淀法提取到了一種小分子的heme綁定蛋白,而在鐵離子限制性的TSB培養(yǎng)基中并沒有提取到。說明此蛋白的表達(dá)是受環(huán)境中血紅素的調(diào)控而不受鐵離子的調(diào)控。隨后,我們進(jìn)一步利用血紅素瓊脂糖去捕獲分泌物中的heme綁定蛋白。結(jié)果同樣驗(yàn)證了該蛋白的存在。通過以上試驗(yàn),表明鴨疫里默氏桿菌可編碼并分泌胞外heme綁定蛋白,我們命名為鴨疫里默氏桿菌hemophore。2鴨疫里默氏桿菌編碼潛在的hemophore由于鴨疫里默氏桿菌可分泌hemophore蛋白,我們試圖通過生物信息學(xué)分析的方法去發(fā)現(xiàn)編碼hemophore蛋白的基因。結(jié)果我們發(fā)現(xiàn),在鴨疫里默氏桿菌RA-GD株基因組注釋中有一條被注釋為"extracellular heme-binding protein"的基因,可能為潛在的hemophore基因。通過序列比對(duì),我們發(fā)現(xiàn)該基因及其同源基因在已測序的4株鴨疫里默氏桿菌中均有編碼且存在一個(gè)基因家族。該基因家族包括3個(gè)基因,我們分別命名為hemophore1、hemophore2、hemophore3,它們之間序列相似性在70%以上。除RA-CH-1只編碼hemophore 1、hemophore2且為雙拷貝外,其余3株鴨疫里默氏桿菌均編碼hemophore1、hemophore2、hemophore3且為單拷貝。信號(hào)肽預(yù)測顯示該家族蛋白均含有信號(hào)肽,亞細(xì)胞定位預(yù)測表明該家族蛋白主要定位于細(xì)胞外。為對(duì)潛在hemophore的功能予以驗(yàn)證,我們對(duì)RA ATCC hemophore 1進(jìn)行了克隆、原核表達(dá)和蛋白純化。功能鑒定結(jié)果顯示,hemophore 1具有綁定血紅素的功能。3鴨疫里默氏桿菌hemophore可作為潛在的抗菌藥物靶點(diǎn)鴨疫里默氏桿菌體外分離培養(yǎng)需要在血平板上才能生長,而在體內(nèi),血液是其感染的重要組織。因此我們推測,血液中的血紅素對(duì)其生長起著至關(guān)重要的作用。通過基因組分析,我們也證明的這一點(diǎn)(Wang X.et al,2014)。如果我們可以阻斷鴨疫里默氏桿菌對(duì)血紅素的需求,我們就可以抑制該菌的生長。根據(jù)競爭性抑制的原理,我們發(fā)現(xiàn)了一種血紅素類似物SDNS,并驗(yàn)證了其在體外的抑菌作用。結(jié)果表明,SDNS可以顯著抑制鴨疫里默氏桿菌的生長。由于hemophore蛋白的分泌是細(xì)菌利用血紅素的第一步,所以我們推測hemophore是SDNS的一個(gè)重要靶向蛋白。SDNS體內(nèi)抗菌作用及安全性評(píng)價(jià)等有待進(jìn)一步研究。
【關(guān)鍵詞】：鴨疫里默氏桿菌 hemophore 血紅素轉(zhuǎn)運(yùn) 鐵 抗菌藥
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.61
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-7
• 縮略詞表7-13
• 第一部分 文獻(xiàn)綜述13-21
• 第一章 革蘭氏陰性菌血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)及hemophore的研究進(jìn)展13-21
• 1. 革蘭氏陰性菌血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)13-19
• 1.1 血紅素來源14-15
• 1.2 血紅素?cái)z取15-16
• 1.2.1 直接的血紅素?cái)z取15
• 1.2.2 Hemophore介導(dǎo)的血紅素?cái)z取15-16
• 1.3 血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)16-18
• 1.3.1 血紅素受體16
• 1.3.2 TonB系統(tǒng)16-17
• 1.3.3 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體17
• 1.3.4 血紅素的儲(chǔ)存和降解17-18
• 1.4 血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控18-19
• 1.4.1 Fur調(diào)控18
• 1.4.2 σ調(diào)控18
• 1.4.3 復(fù)合調(diào)控18-19
• 2. 革蘭氏陰性菌hemophore的研究進(jìn)展19-21
• 2.1 HasA型hemophore19
• 2.2 HuxA型hemophore19
• 2.3 HmuY型hemophore19-21
• 第二部分 試驗(yàn)部分21-68
• 第二章 鴨疫里默氏桿菌hemophore的發(fā)現(xiàn)與鑒定21-32
• 1 試驗(yàn)材料21-24
• 1.1 菌株21
• 1.2 主要試劑21-22
• 1.3 試劑配制22-23
• 1.3.1 細(xì)菌培養(yǎng)相關(guān)試劑配制22
• 1.3.2 蛋白電泳相關(guān)試劑配制22-23
• 1.3.3 Western-blot相關(guān)試劑配制23
• 1.3.4 其它相關(guān)試劑配制23
• 1.4 主要儀器23-24
• 2 試驗(yàn)方法24-26
• 2.1 鴨疫里默氏桿菌分泌蛋白的提取24
• 2.2 胞外heme綁定蛋白的鑒定24-25
• 2.3 Heme瓊脂糖親和層析25
• 2.4 野生型hemophore分泌的優(yōu)化25
• 2.5 野生型hemophore穩(wěn)定性的檢測25-26
• 3 結(jié)果與分析26-30
• 3.1 鴨疫里默氏桿菌分泌蛋白的提取26-27
• 3.2 胞外heme綁定蛋白的鑒定27
• 3.3 Heme瓊脂糖親和層析27-28
• 3.4 野生型hemophore分泌的優(yōu)化28-29
• 3.5 野生型hemophore穩(wěn)定性的檢測29-30
• 4 討論30-32
• 第三章 鴨疫里默氏桿菌潛在hemophore的生物信息學(xué)分析32-44
• 1 試驗(yàn)材料32-33
• 1.1 主要生物信息學(xué)分析軟件及在線分析工具32-33
• 2 試驗(yàn)方法33-34
• 2.1 潛在hemophore基因的查找33
• 2.2 BLASTN分析33
• 2.3 蛋白質(zhì)疏水性分析33
• 2.4 蛋白質(zhì)抗原性及表面性分析33
• 2.5 蛋白質(zhì)信號(hào)肽預(yù)測33-34
• 2.6 蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位34
• 2.7 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測34
• 3 結(jié)果與分析34-43
• 3.1 鴨疫里默氏桿菌中的潛在hemophore基因34-36
• 3.2 鴨疫里默氏桿菌潛在hemophore基因家族36-38
• 3.3 蛋白質(zhì)疏水性分析38-39
• 3.4 蛋白質(zhì)抗原性及表面抗原分析39-40
• 3.5 蛋白質(zhì)信號(hào)肽預(yù)測40
• 3.6 蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位40-41
• 3.7 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測41-43
• 4 討論43-44
• 第四章 潛在hemophore基因的克隆、表達(dá)、蛋白純化及其功能驗(yàn)證44-63
• 1 試驗(yàn)材料44-46
• 1.1 菌株44
• 1.2 質(zhì)粒44
• 1.3 主要試劑44
• 1.4 試劑配制44-46
• 1.4.1 細(xì)菌培養(yǎng)相關(guān)試劑配制44-45
• 1.4.2 核酸電泳相關(guān)試劑配制45
• 1.4.3 蛋白電泳相關(guān)試劑配制45
• 1.4.4 Western blot相關(guān)試劑配制45
• 1.4.5 蛋白純化相關(guān)試劑配制45
• 1.4.6 其它相關(guān)試劑配制45-46
• 1.5 主要儀器設(shè)備46
• 2 試驗(yàn)方法46-53
• 2.1 引物設(shè)計(jì)與合成46-47
• 2.2 潛在hemophore的PCR擴(kuò)增47
• 2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的回收47-48
• 2.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建48-51
• 2.4.1 載體質(zhì)粒的提取48
• 2.4.2 基因片段及質(zhì)粒的酶切和回收48-49
• 2.4.3 連接49
• 2.4.4 感受態(tài)細(xì)胞的制備49
• 2.4.5 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化49-50
• 2.4.6 陽性克隆的PCR鑒定50-51
• 2.4.7 陽性質(zhì)粒的提取及測序51
• 2.5 表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)51-52
• 2.5.1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌51
• 2.5.2 表達(dá)菌陽性克隆的PCR鑒定51
• 2.5.3 誘導(dǎo)表達(dá)51-52
• 2.5.4 重組蛋白的SDS-PAGE檢測52
• 2.6 重組蛋白的純化52-53
• 2.6.1 重組蛋白的大量表達(dá)52
• 2.6.2 蛋白純化52-53
• 2.7 潛在hemophore的功能驗(yàn)證53
• 3 結(jié)果與分析53-60
• 3.1 潛在hemophore基因擴(kuò)增53-54
• 3.2 PCR產(chǎn)物回收54
• 3.3 質(zhì)粒提取54-55
• 3.4 酶切及連接55
• 3.5 轉(zhuǎn)化55-57
• 3.6 PCR鑒定陽性克隆57
• 3.7 測序鑒定結(jié)果57
• 3.8 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)57-59
• 3.9 重組蛋白的純化59-60
• 3.10 潛在hemophore的功能驗(yàn)證60
• 4 討論60-63
• 第五章 hemophore作為抗菌靶點(diǎn)的探索63-68
• 1 試驗(yàn)材料63
• 1.1 菌株63
• 1.3 主要試劑63
• 1.4 試劑配制63
• 1.5 主要儀器63
• 2 試驗(yàn)方法63-64
• 2.1 SDNS最小抑菌濃度的測定64
• 2.2 抑菌生長曲線測定64
• 3 結(jié)果與分析64-66
• 4 討論66-68
• 參考文獻(xiàn)68-73
• 第三部分 致謝73-74
• 附錄74-75
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄75

【相似文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：264069