【摘要】：尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)屬于鱸形目、麗魚科,因其生長性能優(yōu)良、抗逆性強(qiáng)和營養(yǎng)豐富等特點(diǎn),被廣泛養(yǎng)殖。尼羅羅非魚是淡水廣鹽性硬骨魚類,經(jīng)過鹽度馴化的尼羅羅非魚可以在32psu的鹽度下生存(么宗利等,2003)。尼羅羅非魚的咸水馴化不僅能夠?yàn)閿U(kuò)大產(chǎn)量提供新的研究思路,還可以進(jìn)一步揭示廣鹽性硬骨魚類滲透壓調(diào)節(jié)的奧秘。但是高鹽度馴化會(huì)引發(fā)生長、增殖、發(fā)育等方面的問題。迄今,已經(jīng)有大量的研究致力于探索尼羅羅非魚在鹽度馴化過程中生理生化水平的變化,但是還沒有文獻(xiàn)能夠揭示整體的分子水平的響應(yīng),以及鹽度馴化下的能量代謝概貌。本文以可能的硬骨魚類的新型能量變化感應(yīng)器—腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)為切入點(diǎn),論證AMPK具有感應(yīng)能量變化的功能,與此同時(shí),揭示尼羅羅非魚在急、慢性高鹽馴化下能量物質(zhì)的響應(yīng)。此外,利用RNA-Seq技術(shù)確定了尼羅羅非魚肝臟響應(yīng)高鹽度脅迫的代謝通路和基因�；谵D(zhuǎn)錄組分析結(jié)果,重點(diǎn)關(guān)注膽固醇相關(guān)的通路,并發(fā)現(xiàn)飼料中適宜水平的膽固醇能夠通過調(diào)控HPI軸來達(dá)到緩解高鹽度對(duì)羅非魚脅迫的目的,為解決淡水硬骨魚類在高鹽環(huán)境中的不良反應(yīng)提供了參考依據(jù)。主要結(jié)果如下:1.急性高鹽脅迫對(duì)尼羅羅非魚的AMPK表達(dá)和能量物質(zhì)含量的影響腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)作為一種能量感應(yīng)器在哺乳動(dòng)物研究中引起了廣泛的興趣,其中α催化亞基的磷酸化對(duì)該酶的活性起決定作用。為研究魚類中AMPK的基本信息以及是否同樣扮演著能量變化感受器的角色,實(shí)驗(yàn)先以AMPKα亞基為代表,通過分段克隆、生物信息學(xué)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)研究該基因在尼羅羅非魚中的核酸序列,序列特性以及組織分布;隨后對(duì)尼羅羅非魚(10.92±1.25g)進(jìn)行96h急性16psu鹽度脅迫,以0psu組為對(duì)照組,在0h,6h,12h,24h,48h和96h依次取樣,檢測血清中的葡萄糖、乳酸和甘油三酯的含量,以及肝臟和肌肉中的糖原、乳酸、可溶性蛋白和AMPK的酶活力。結(jié)果顯示,AMPKα亞基含有α1(1753bp)和α2(2563bp)兩種亞型,分別編碼571和557個(gè)氨基酸,分子質(zhì)量分別是64 kDa和52 kDa。AMPKα1和AMPKα2共有的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)特征N-末端的TTr172位點(diǎn)與哺乳動(dòng)物一致。并且,α亞基與其他魚類物種以及脊椎動(dòng)物的AMPKα亞基的同源性高達(dá)81.3%-98.1%,在組織中分布廣泛。鹽度脅迫實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在16 psu組肝臟中,6h和24h時(shí)AMPK的活力顯著高于0 psu組(P0.05),且16psu組的AMPK活力隨時(shí)間的增加而升高,在24h處達(dá)到頂峰,隨后活力下降并恢復(fù)到0 h 水平(P0.05)。肌肉中48h時(shí)AMPK的活力顯著高于0 psu組(P0.05),兩個(gè)組均呈現(xiàn)隨時(shí)間先上升后下降的變化趨勢。在16psu組中,12h時(shí)血糖水平顯著高于0 psu組(P0.05),96h時(shí)乳酸水平顯著高于0 psu組(P0.05)。相同時(shí)間點(diǎn)兩組的甘油三酯含量沒有差異,但均隨時(shí)間的延長而降低(P0.05)。肌肉中,16psu組的乳酸在48h和96h處顯著高于0psh組(P0.05),肌肉中兩組的肌糖原含量未發(fā)生顯著差異,但是均隨時(shí)間的延長而顯著降低(P0.05)。16 psu組肌肉中的可溶性蛋白濃度在12h處顯著高于0psu組(P0.05)。兩組肝臟中的肝糖原顯著隨時(shí)間增加而降低(P0.05),乳酸的濃度在6h,12h,24h和96h處顯著高于對(duì)照組,且濃度隨時(shí)間的增加而增加(P0.05)。以上結(jié)果為進(jìn)一步研究AMPK在魚體中的功能奠定研究基礎(chǔ),同時(shí)也證明AMPK在急性鹽度脅迫下確實(shí)起著能量變化感受器的作用,為探索鹽度脅迫下能量代謝的研究提供參考。2.慢性高鹽馴化下尼羅羅非魚的能量物質(zhì)變化及肝臟轉(zhuǎn)錄組學(xué)的分析本實(shí)驗(yàn)旨在探究慢性鹽度馴化對(duì)尼羅羅非魚的能量物質(zhì)含量和肝臟轉(zhuǎn)錄組的影響。隨機(jī)將尼羅羅非魚幼魚(0.88±0.04 g)分成3個(gè)組,每個(gè)組3個(gè)平行,分別在0 psu、8 psu和16 psu的環(huán)境中養(yǎng)殖8周,用RNA-Seq的方法對(duì)肝臟的總RNA進(jìn)行測序�；诓町惢虻谋磉_(dá)構(gòu)建差異基因庫,按照基因在3個(gè)鹽度下的表達(dá)量將差異基因庫中的差異基因分成3類:持續(xù)變化趨勢;變化-不變趨勢;不變-變化趨勢。在持續(xù)變化趨勢中,類固醇生物合成、類固醇激素生物合成、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)、脂肪消化和吸收發(fā)生顯著的變化,表明上述通路與環(huán)境鹽度變化有著密切的聯(lián)系。在變化-不變趨勢中,核糖體、氧化磷酸化、過氧化物增殖物激活受體的信號(hào)通路,以及消化和吸收通路都發(fā)生顯著性變化,提示這些通路對(duì)環(huán)境的鹽度變化具有很強(qiáng)的敏感性,且調(diào)控能力有限,所以具有一定的閾值。在不變-變化趨勢中,蛋白質(zhì)輸出、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、緊密連接、甲狀腺激素合成、抗原處理和呈現(xiàn)、糖酵解/糖異生和糖胺聚糖合成-硫酸角質(zhì)素顯著變化,表明這些通路在低鹽度時(shí)足夠調(diào)節(jié)機(jī)體的變化,但是當(dāng)鹽度超過一定閾值時(shí),這些通路就會(huì)發(fā)生變化以維持機(jī)體的正常生理狀態(tài)。本研究全面地揭示了在鹽度馴化過程中尼羅羅非魚mRNA分子層面的變化,通過上述分析,發(fā)現(xiàn)膽固醇參與的代謝通路可能在羅非魚的能量適應(yīng)中起著尤其關(guān)鍵的作用,也為今后更全面地理解和解決鹽度脅迫提供研究基礎(chǔ)。此外,分別檢測0psu和16psu組血清中的葡萄糖、乳酸和甘油三酯的含量以及肝臟和肌肉中的糖原、乳酸和可溶性蛋白的含量。結(jié)果顯示,16 psu組的血清、肌肉和肝臟的乳酸水平顯著高于0psu組(P0.05),組織中的糖原顯著低于0psu組(P0.05)。上述結(jié)果提示,在長期鹽度脅迫中,尼羅羅非魚需要花費(fèi)更多的能量來維持正常的生理平衡。雖然羅非魚的能量代謝已經(jīng)重新進(jìn)入了平衡狀態(tài),但是不完全的有氧呼吸還是使得體內(nèi)的乳酸處于高水平狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)AMPK的亞基的mRNA水平發(fā)生顯著性變化,也證明AMPK只參與短期內(nèi)的能量變化,在能量平衡后不起到關(guān)鍵調(diào)控作用。3.高鹽度下尼羅羅非魚飼料中膽固醇的營養(yǎng)作用研究根據(jù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)的結(jié)果,在飼料中添加不同水平的膽固醇以探討額外添加膽固醇是否對(duì)尼羅羅非魚的鹽度脅迫具有緩解作用及調(diào)節(jié)途徑。選取規(guī)格相當(dāng)?shù)哪崃_羅非魚幼魚(2.20 ± 0.12 g)隨機(jī)分配成6個(gè)組,每個(gè)組3個(gè)平行缸,每個(gè)缸29尾。依次飼喂膽固醇含量為0%,0.4%,0.8%,1.2%,1.6%和2.4%的純化飼料。在16psu環(huán)境中飼養(yǎng)8周,記錄生長數(shù)據(jù)。檢測血清和肝臟中的膽固醇、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)和低密度脂蛋白(LDL-C)的含量;檢測頭腎的11β-羥基類固醇脫氫2(11β-HSD2)、20β-羥基類固醇脫氫酶2(20β-HSD2)和膽固醇側(cè)鏈裂解酶P450(P450scc)和肝臟的糖皮質(zhì)激素受體1(GR1)和GR2B的RNA水平,并且檢測鰓絲的Na+/K+-ATP酶活性以及血清中皮質(zhì)醇的濃度。結(jié)果顯示,飼料中膽固醇添加量為0.4%時(shí)的增重率顯著高于其他各組,飼料系數(shù)顯著低于其他組(P0.05)。血清和肝臟中的膽固醇以及血清中LDL-C的水平隨著飼料中膽固醇濃度的增加而上升(P0.05)。血清GSH隨膽固醇增加而增加,SOD隨之而減少(P0.05)。肝臟GSH隨膽固醇的增加而降低(P0.05),SOD無明顯變化。與0%組相比,其他組的頭腎中P450scc的含量沒有顯著差異。11β-HSD2的mRNA水平在0%組最高,隨膽固醇濃的升高而顯著下降(P0.05)。20β-HSD2的mRNA水平在膽固醇濃度為0.4%和1.2%時(shí)顯著高于其他組,在1.6%組中mRNA含量最低(P0.05)。當(dāng)膽固醇濃度為0.8%時(shí),GR1和GR2的mRNA含量最高(P0.05)。隨著膽固醇含量升高,第二鰓弓的鰓絲中Na+/K+-ATP酶的活性先上升后下降,在0.4%組最高(P0.05)。血清中的皮質(zhì)醇濃度隨飼料中膽固醇水平的增加而升高,但當(dāng)膽固醇含量超過0.8%時(shí),血清中皮質(zhì)醇的濃度不再上升(P0.05)。以上結(jié)果表明,在鹽度脅迫下,膽固醇不是尼羅羅非魚存活的必需品,但是可以作為飼料營養(yǎng)素添加劑。膽固醇通過HPI軸參與調(diào)控尼羅羅非魚對(duì)半咸水環(huán)境的適應(yīng)能力。飼料中添加低濃度膽固醇會(huì)對(duì)魚體產(chǎn)生正面的效應(yīng),高濃度反而抑制。飼料中膽固醇含量為0.4%-0.8%最有利于羅非魚咸水養(yǎng)殖。
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2617470