本文關(guān)鍵詞：紅苞鳳梨金邊嵌合體白化細(xì)胞葉綠素合成限速基因挖掘，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：本文以紅苞鳳梨金邊嵌合體扦插植株以及組織培養(yǎng)所獲得的全綠、全白植株為典型材料,通過DNA-AFLP分子標(biāo)記分析和轉(zhuǎn)錄組測序分析,并結(jié)合葉綠素合成前體物質(zhì)含量測定,尋找紅苞鳳梨金邊嵌合體白化細(xì)胞與綠色細(xì)胞在基因組DNA水平和mRNA轉(zhuǎn)錄水平上的差異,挖掘白化細(xì)胞葉綠素合成的關(guān)鍵限速基因,并利用Reeal time PCR技術(shù)對關(guān)鍵基因進(jìn)行表達(dá)模式分析,進(jìn)一步驗(yàn)證其可能功能。獲得的主要研究結(jié)果如下：1.建立了一套較為穩(wěn)定完善的紅苞鳳梨DNA-AFLP分析技術(shù)體系,包括DNA提取、銀染、和顯影,并利用該體系對紅苞鳳梨組培全綠植株和全白植株進(jìn)行了檢測。本研究隨機(jī)選用69對AFLP引物對紅苞鳳梨組培全綠和全白植株進(jìn)行選擇性擴(kuò)增,選擇性擴(kuò)增結(jié)果顯示,紅苞鳳梨組培全綠苗與全白苗的擴(kuò)增條帶一致,并沒有存在多態(tài)性條帶。紅苞鳳梨組培全綠苗與全白苗在我們使用的69對引物間并未發(fā)現(xiàn)基因組DNA長度的顯著差異。2.以紅苞鳳梨嵌合體植株的葉、莖、根及帶紅暈葉片為材料,通過RNA-seq測序,得到初始reads 23.5M對,總堿基數(shù)為4.76 Gb。在測序質(zhì)量值統(tǒng)計(jì)評估方面,平均Q20為100%,堿基Q30為93.54%,GC含量為50.33%。通過對原始數(shù)據(jù)的過濾并利用Trinity軟件進(jìn)行拼接,共得到41,052條Unigenes,平均長度為877.62bp。與公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,共有23,275條unigenes比對到NCBI數(shù)據(jù)庫,23,134條unigenes比對到Swiss-Port數(shù)據(jù)庫。其中,比對到GO和COG數(shù)據(jù)庫的unigenes分別為17,748和8,505條,共有5825條Unigenes被KEGG注釋參與到117個KEGG代謝通路,其中參與到卟啉和葉綠素代謝途徑(Ko號：Ko00860)的Unigene共有39條。3.紅苞鳳梨金邊嵌合體綠葉部分的葉綠素a含量和葉綠素b含量及總?cè)~綠素含量分別為為白葉部分的35.2倍、16.7倍和24.18倍,說明白色葉葉綠素合成受阻,葉綠素含量顯著下降。葉綠素合成中間代謝物6-氨基乙酰丙酸(ALA)含量和膽色素原(PBG)含量在綠葉與白葉間無顯著差異,但自尿卟啉原Ⅲ(Uroporphyrinogen Ⅲ)開始白葉含量極顯著減少,綠葉Uro Ⅲ含量是白葉的4.7倍。同時,之后的糞卟啉原Ⅲ(CoprogenⅢ)、原卟啉Ⅸ (ProtoIX)、鎂原卟啉Ⅸ (Mg-ProtoIX)、原脫植基葉綠素(Pchlide)含量在白葉中均極顯著低于綠葉,說明PBG到Uro Ⅲ的轉(zhuǎn)化是紅苞鳳梨白化細(xì)胞葉綠素合成受阻的限速步驟。4.本實(shí)驗(yàn)以5對可以擴(kuò)增出清晰條帶,無引物二聚體和非特異性擴(kuò)增的候選內(nèi)參基因在紅苞鳳梨綠葉、白葉樣品中進(jìn)行Real time qPCR擴(kuò)增,采用geNorm和NormFinder兩個軟件進(jìn)行候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析,結(jié)果顯示18S rRNA為紅苞鳳梨葉片組織中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。5.采用Real time qPCR對葉綠素合成代謝途徑的12個基因(hemA、hemB、hemC、 hemD、hemE、hemG、hemH、CAO、ACC、ChlD、Chlll、ChlM)在紅苞鳳梨組培全綠苗和全白苗中的表達(dá)模式進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示,一共有7個基因相對于全綠苗在全白苗中表達(dá)受抑,分別是hemA、hemC、hemE、CAO、ACC、ChlD。催化PBG到Uro Ⅲ轉(zhuǎn)化的hemC可能在白化細(xì)胞失綠中起關(guān)鍵作用,為紅苞鳳梨金邊嵌合體白化細(xì)胞葉綠素合成關(guān)鍵限速基因。
【關(guān)鍵詞】：紅苞鳳梨 白化失綠 葉綠素合成 限速基因
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S682.36
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 縮略詞表7-11
• 前言11-12
• 1 文獻(xiàn)綜述12-17
• 1.1 植物嵌合體及形成方式12-13
• 1.1.1 植物嵌合體概述12
• 1.1.2 植物嵌合體形成方式12-13
• 1.2 植物白化細(xì)胞失綠的分子機(jī)制13-15
• 1.2.1 葉綠素代謝途徑受阻13-14
• 1.2.2 葉綠體分化與發(fā)育相關(guān)基因的突變14
• 1.2.3 核-質(zhì)互作效應(yīng)導(dǎo)致失綠14
• 1.2.4 編碼非光合系統(tǒng)基因突變14-15
• 1.3 轉(zhuǎn)錄組測序與功能基因挖掘15-16
• 1.3.1 轉(zhuǎn)錄組測序原理15
• 1.3.2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析15-16
• 1.3.3 轉(zhuǎn)錄組功能基因挖掘16
• 1.4 技術(shù)路線16-17
• 2 紅苞鳳梨DNA-AFLP分析17-26
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料17
• 2.2 實(shí)驗(yàn)儀器17
• 2.3 實(shí)驗(yàn)試劑17
• 2.4 實(shí)驗(yàn)方法17-23
• 2.4.1 紅苞鳳梨基因組DNA提取17-18
• 2.4.2 DNA質(zhì)量檢測18-19
• 2.4.3 AFLP體系的建立19-23
• 2.4.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳23
• 2.4.5 銀染23
• 2.5 結(jié)果與分析23-26
• 2.5.1 基因組DNA質(zhì)量檢測23-24
• 2.5.2 AFLP預(yù)擴(kuò)增結(jié)果24
• 2.5.3 選擇性擴(kuò)增結(jié)果24-26
• 3 紅苞鳳梨轉(zhuǎn)錄組分析26-38
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料26
• 3.2 實(shí)驗(yàn)儀器26
• 3.3 實(shí)驗(yàn)試劑26
• 3.4 實(shí)驗(yàn)方法26-29
• 3.4.1 紅苞鳳梨總RNA的提取26-27
• 3.4.2 總RNA瓊脂糖凝膠電泳27
• 3.4.3 總RNA紫外分光光度計(jì)檢測27
• 3.4.4 轉(zhuǎn)綠組測序27
• 3.4.5 轉(zhuǎn)錄組測序信息分析27-29
• 3.5 結(jié)果與分析29-38
• 3.5.1 總RNA質(zhì)量檢測29
• 3.5.2 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與評估29-38
• 4 紅苞鳳梨葉綠素合成前體物質(zhì)含量分析38-41
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料38
• 4.2 測定項(xiàng)目與方法38-39
• 4.2.1 δ-氨基乙酰丙酸(ALA)含量測定38
• 4.2.2 膽色素原(PBG)含量測定38
• 4.2.3 尿卟啉原Ⅲ(Uroporphyrinogen Ⅲ)和糞卟啉原Ⅲ(CoprogenⅢ)含量測定38-39
• 4.2.4 原卟啉Ⅸ(Protoporphyrin Ⅸ)、鎂原卟啉Ⅸ(Mg-ProtoⅨ)、原葉綠素酸脂(Pchlide)含量測定39
• 4.2.5 葉綠素含量測定39
• 4.3 結(jié)果與分析39-41
• 4.3.1 紅苞鳳梨葉片全綠部分與全白部分葉綠素合成前體物含量差異39-41
• 5 紅苞鳳梨內(nèi)參基因的篩選41-51
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料41
• 5.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑41
• 5.2.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器41
• 5.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑41
• 5.3 實(shí)驗(yàn)方法41-45
• 5.3.1 內(nèi)參基因引物設(shè)計(jì)41-42
• 5.3.2 引物篩選42-45
• 5.4 結(jié)果與分析45-51
• 5.4.1 內(nèi)參基因PCR擴(kuò)增結(jié)果45-46
• 5.4.2 內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線制備結(jié)果46-49
• 5.4.3 內(nèi)參基因在不同樣品中的qRT-PCR結(jié)果49-50
• 5.4.4 內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析50-51
• 6 紅苞鳳梨葉綠素合成相關(guān)基因REAL TIME QPCR表達(dá)分析51-60
• 6.1 實(shí)驗(yàn)材料、儀器與試劑51
• 6.2 實(shí)驗(yàn)方法51-53
• 6.2.1 目的基因引物設(shè)計(jì)51
• 6.2.2 PCR擴(kuò)增與標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備51-52
• 6.2.3 Real time qPCR52-53
• 6.3 結(jié)果與分析53-60
• 6.3.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果53
• 6.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備結(jié)果53-59
• 6.3.3 Real time qPCR結(jié)果59
• 6.3.4 紅苞鳳梨自化細(xì)胞葉綠素合成受阻關(guān)鍵基因篩選59-60
• 7 討論60-65
• 7.1 紅苞鳳梨綠、白組織基因組DNA差異分析60-61
• 7.2 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果極大地豐富了紅苞鳳梨基因序列信息61-62
• 7.3 紅苞鳳梨白化細(xì)胞葉綠素合成受阻關(guān)鍵步驟62-63
• 7.4 紅苞鳳梨內(nèi)參基因篩選63
• 7.5 葉綠素合成代謝基因表達(dá)模式分析及關(guān)鍵基因篩選63-64
• 7.6 實(shí)驗(yàn)方法改進(jìn)64-65
• 7.6.1 DNA提取64
• 7.6.2 RNA提取64
• 7.6.3 UroⅢ提取64-65
• 8 結(jié)論65-66
• 參考文獻(xiàn)66-70
• 致謝70-71
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄71

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