【摘要】：植物病毒病在世界范圍內(nèi)廣泛存在,它是僅次于真菌病害的一大病害,嚴重危害重要的經(jīng)濟作物。隨著基因工程的迅速發(fā)展,使得利用抗病育種這一技術防治植物病毒病得到更為廣泛的應用。近年的研究表明,將核糖體失活蛋白(ribosome-inactivating proteins,RIPs)基因轉(zhuǎn)化植物,轉(zhuǎn)基因植物獲得抗病毒能力。因此,本文克隆獲得四種核糖體失活蛋白(無毒缺失突變體PAP-c、α-MC、MAP30、Luffin-a),將四種RIPs在本氏煙中異源表達,在煙草中觀察四個蛋白在細胞中的定位情況。研究RIPs對煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)的抑制作用及其引起的抗性防御反應。為解釋不同RIPs對植物病毒的抗性作用及對RIPs誘導植物產(chǎn)生抗性抵御病毒侵染的作用提供依據(jù)。根據(jù)GenBank中已報道的商陸抗病毒蛋白基因、絲瓜核糖體失活蛋白基因和苦瓜素基因全序列,設計并合成擴增PAP-c和α-MC、MAP30、Luffin-a基因全長引物,通過RT-PCR及基因克隆方法,從苦瓜、絲瓜和商陸春葉克隆得到苦瓜α-MC、MAP30、絲瓜Luffin-a和商陸PAP-c;用Wolf PSORT預測蛋白定位,將苦瓜α-MC、MAP30、絲瓜Luffin a和商陸PAP-c融合在GFP的N端,構建融合綠色熒光蛋白的瞬時表達載體,亞細胞定位根據(jù)融合標記的GFP來確定,從而驗證預測結(jié)果;在本氏煙中植物中通過根癌農(nóng)桿菌介導的方法瞬時表達RIPs,再接種TMV,病毒在接種葉片的蛋白表達量和RNA積累量通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和熒光定量RT-PCR兩種方法檢測,分析瞬時表達RIPs的抗病毒效果。利用實時熒光定量RT-PCR檢測植物防衛(wèi)相關基因NPR1、PR1、PR2的表達,探究RIPs的抗病毒機理�？寺〉玫交颚�-MC、MAP30、Luffin-a和PAP-c,分別為861、861、831和711 bp。Wolf PSORT預測顯示RIPs主要定位于細胞質(zhì)膜上。用共聚焦熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),標記GFP的RIPs均定位在本氏煙葉片表皮細胞質(zhì)膜上,與Wolf PSORT預測的RIPs定位結(jié)果相一致。異源表達四種RIPs的植物細胞無明顯毒性,表達部位細胞完整。在本氏煙中異源表達RIPs后,再接種TMV-GFP,在紫外燈下觀察發(fā)現(xiàn)四種RIPs處理后的本氏煙在接種TMV-GFP 48 h后沒有出現(xiàn)綠色熒光,而對照組出現(xiàn)熒光。72 h后處理組出現(xiàn)零星熒光,但對照組的綠色熒光開始擴散,連續(xù)觀察,處理組幾乎沒有變化,接種TMV-GFP 6天后,發(fā)現(xiàn)處理組的綠色熒光幾乎沒有擴大的趨勢,而對照組的綠色熒光已擴散至心葉;ELISA檢測表明,在接種TMV-GFP 6天后的葉片中,對照組與健康植物的OD492比值幾乎已達到處理組的10倍以上;實時熒光定量PCR檢測TMV RNA的含量,結(jié)果顯示對照組TMV RNA表達量是處理組的149倍,表明四個RIPs對TMV復制和移動都有明顯抑制;實時熒光定量PCR結(jié)果分析顯示,NPR1基因在只注射TMV、單獨分別表達α-MC、MAP30、Luffin-a以及分別表達α-MC、MAP30、Luffin-a后注射TMV的本氏煙中都被誘導表達,但后者的表達量是前兩個處理的約1.5-3倍左右,在只分別接種α-MC、MAP30、Luffin-a和分別表達α-MC、MAP30、Luffin-a后注射TMV的本氏煙中都檢測到PR1、PR2,但后者的表達量顯著高出前者約5-7倍,表明異源表達RIPs對植物病毒的抗性作用可誘導植物中防衛(wèi)相關基因NPR1、PR1、PR2的表達,從而引起更強的防御反應。異源表達RIPs顯著抑制TMV,能夠激活植物防衛(wèi)反應,且對植物細胞無明顯毒性。研究結(jié)果為利用異源表達RIPs方法開發(fā)控制植物病毒新產(chǎn)品提供了參考依據(jù)。
【圖文】：

絲瓜毒蛋白、皂草素等[68]。該類型的蛋白只有一條多肽鏈組成，由于缺少結(jié)合的配體 B 鏈不能進入到細胞內(nèi)，因此對細胞具有較小的毒性。 型核糖體失活蛋白的數(shù)量相對較少，只在 8 種植物中有發(fā)現(xiàn)[67]。這類 RIPs異源二聚體蛋白，分子量約為 60 kDa，由 A 鏈和 B 鏈等兩條鏈組成，A有 RNA N-糖苷酶活性的，B 鏈是一個對半乳糖專一的凝集素，其作用可核細胞表面的糖蛋白結(jié)合，從而使 A 鏈逆向進入到胞質(zhì)溶膠，參與蛋白翻，從而阻止蛋白質(zhì)的合成。此外，極少數(shù)的 RIPs 由 4 條多肽鏈組成，是一體由兩個相同的雙鏈 RIPs 結(jié)合在一起形成的。 III 類型的 RIPs 較為少見，目前為止，在玉米和大麥中被發(fā)現(xiàn)，也有學者類型是 I 型的變種。III 型 RIPs 是先通過合成無活性的前體，然后進行酶，在形成活性位點的所有氨基酸之間進行切割，如玉米中的 b-32 蛋白，通部切割加工后，產(chǎn)生兩條大小分別為 16.5 KDa 和 8.5 KDa 的多肽鏈亞基，玉米中發(fā)現(xiàn)的兩種 RIPs 都是屬于 III 型。

第一章 文獻綜述，能夠水解幾乎所有生物來源的核糖體，導致核糖體失IPs 的 RNAN-糖苷酶活性，真核生物 28S rRNA 上第 A4之間的 N-C 糖苷鍵幾乎能被大部分的核糖體失活蛋白水放，從而使延長因子 EF-2 不能跟核糖體結(jié)合，最終阻止NA 水解酶活性，研究表明，，核糖體 28S rRNA 第 G432鍵能夠被部分核糖體失活蛋白專一性的切割，在 3’端切白構象發(fā)生改變，進而導致 tRNA 和核糖體無法結(jié)合，有研究發(fā)現(xiàn)，從巨曲霉（Aspergillus giganteus）中分離出種 RNase。最新的研究表明，苦瓜中的 α-苦瓜素和 β-苦A 的功能[70]。
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S432.41

【參考文獻】

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1 牙庫甫江·阿西木;阿斯古麗·伊斯馬伊力;王韻婧;劉玉樂;;植物抗病毒基因工程研究進展[J];生物工程學報;2015年06期

2 曹東亮;金家貴;沈富兵;;苦瓜核糖體失活蛋白廣泛的生物學功能[J];成都醫(yī)學院學報;2014年05期

3 孫曉東;王燕;羅超;王s

本文編號：2584986