發(fā)布時(shí)間：2020-02-08 17:40

【摘要】：竹子作為重要的森林資源在保障我國木材安全、生態(tài)安全等方面發(fā)揮著重要作用。漆酶(Laccase,LAC)是一種銅藍(lán)氧化酶,參與木質(zhì)素單體聚合以及非生物脅迫響應(yīng)。本文以毛竹(Phyllostachysedulis)為實(shí)驗(yàn)材料,在對(duì)LAC家族基因進(jìn)行了全基因組分析的基礎(chǔ)上,重點(diǎn)對(duì)2個(gè)漆酶基因PeLAC和PeLAC190進(jìn)行了研究,以期為竹子分子育種提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:1.通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),在毛竹基因組中共有LAC基因同源序列23條,其基因結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)存在著明顯差異。構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明,這些基因分別屬于5個(gè)亞家族,其內(nèi)含子數(shù)量從1-7個(gè)不等,同一亞家族中的內(nèi)含子個(gè)數(shù)也存在一定的差異。利用毛竹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析各PeLACs基因在不同組織中的表達(dá)模式,結(jié)果表明不同PeLACs基因在毛竹根、莖、葉、鞭、20 cm、50 cm筍、早花期花序和晚花期花序中的表達(dá)量存在明顯差異,表明它們?cè)诿癫煌M織中可能發(fā)揮著不同的作用。2.采用同源克隆的方法,從毛竹中分離獲得了2個(gè)LACs同源基因,分別命名為PeLAC和PeLAC190,它們的cDNA序列分別為1 692 bp和1 719 bp,對(duì)應(yīng)的基因組序列為2785 bp和2391bp,二者均有6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子。psRNATarget分析發(fā)現(xiàn)PeLAC和PeLAC190中均存在miR397靶點(diǎn)。PeLAC和PeLAC190分別編碼563個(gè)和572個(gè)氨基酸,均具有漆酶特有的3個(gè)銅離子保守結(jié)構(gòu)域,以及漆酶活性中心必須的10個(gè)組氨酸殘基及1個(gè)半胱氨酰殘基。另外,還獲得了毛竹Phe-miR397的88bp前體序列。3.利用RLM-5'RACE技術(shù),驗(yàn)證了Phe-miR397對(duì)PeLAC和PeLAC190具有切割作用,切割位點(diǎn)均位于靶點(diǎn)的第10-11位堿基之間。在毛竹不同高度筍中,Phe-miR397的表達(dá)與PeLAC、PeLAC190呈相反趨勢(shì),進(jìn)一步證明了Phe-miR397可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控PeLAC和PeLAC190的表達(dá)。PeLAC和PeLAC190在毛竹中為組成型表達(dá),且均在莖里表達(dá)豐度最高,根中次之。NaCl(400 mmol·L 1)和ABA(100μmol·L-1)誘導(dǎo)PeLAC和PeLAC190的表達(dá),而受GA3(100μmol·L-1)的抑制;CuSO4(5 mmol·L-1)對(duì)PeLAC190的表達(dá)影響不明顯,而抑制PeLAC,表明二者在激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及響應(yīng)逆境脅迫中可能發(fā)揮著重要作用。4.分別構(gòu)建Phe-miR397以及PeLAC和PeLAC190的過表達(dá)載體,采用浸花法轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥。結(jié)果表明,與野生型相比,PeLAC和PeLAC190轉(zhuǎn)基因植株均出現(xiàn)植株變小,葉柄變長的現(xiàn)象,莖木質(zhì)素含量增加;而Phe-miR397轉(zhuǎn)植株根系生長快。干旱處理?xiàng)l件下,PeLAC和PeLAC190轉(zhuǎn)基因植株抗旱性增強(qiáng),Phe-miR397轉(zhuǎn)基因植株抗旱性減弱。酚酸處理后PeLAC和PeLAC190轉(zhuǎn)基因植株成活率高于野生型。由此表明,PhemiR397及其靶基因PeLAC、PeLAC190參與木質(zhì)素合成及非生物脅迫響應(yīng)。5.構(gòu)建包含自身信號(hào)肽PeLAC的酵母表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株GS115,在含有0.3 mmol·L-1 CuSO4和0.2 mmol·L-1 ABTS的MM平板上劃線培養(yǎng),經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后呈現(xiàn)墨綠色,證明獲得陽性克隆。陽性克隆經(jīng)液體培養(yǎng)誘導(dǎo),取上清進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè),結(jié)果顯示約在77 kDa有一條特異條帶,與預(yù)期融合蛋白相符。體外酶活分析表明,經(jīng)誘導(dǎo)48 h具有活性的PeLAC蛋白,活力最大為2.031 U·m L-1;酶促反應(yīng)最適pH為4.0,溫度40℃。由此表明,利用畢赤酵母表達(dá)PeLAC能夠獲得具有生物活性的酶蛋白。本研究為揭示毛竹漆酶基因在木質(zhì)素合成及非生物脅迫中的功能提供了參考依據(jù),也為進(jìn)一步利用基因工程手段來調(diào)控植物木質(zhì)素含量和抗逆育種提供了新的基因資源。
【學(xué)位授予單位】：中國林業(yè)科學(xué)研究院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S795.7

【參考文獻(xiàn)】

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