【摘要】：竹子作為重要的森林資源在保障我國木材安全、生態(tài)安全等方面發(fā)揮著重要作用。漆酶(Laccase,LAC)是一種銅藍氧化酶,參與木質(zhì)素單體聚合以及非生物脅迫響應。本文以毛竹(Phyllostachysedulis)為實驗材料,在對LAC家族基因進行了全基因組分析的基礎上,重點對2個漆酶基因PeLAC和PeLAC190進行了研究,以期為竹子分子育種提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:1.通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn),在毛竹基因組中共有LAC基因同源序列23條,其基因結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)存在著明顯差異。構(gòu)建系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果表明,這些基因分別屬于5個亞家族,其內(nèi)含子數(shù)量從1-7個不等,同一亞家族中的內(nèi)含子個數(shù)也存在一定的差異。利用毛竹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析各PeLACs基因在不同組織中的表達模式,結(jié)果表明不同PeLACs基因在毛竹根、莖、葉、鞭、20 cm、50 cm筍、早花期花序和晚花期花序中的表達量存在明顯差異,表明它們在毛竹不同組織中可能發(fā)揮著不同的作用。2.采用同源克隆的方法,從毛竹中分離獲得了2個LACs同源基因,分別命名為PeLAC和PeLAC190,它們的cDNA序列分別為1 692 bp和1 719 bp,對應的基因組序列為2785 bp和2391bp,二者均有6個外顯子和5個內(nèi)含子。psRNATarget分析發(fā)現(xiàn)PeLAC和PeLAC190中均存在miR397靶點。PeLAC和PeLAC190分別編碼563個和572個氨基酸,均具有漆酶特有的3個銅離子保守結(jié)構(gòu)域,以及漆酶活性中心必須的10個組氨酸殘基及1個半胱氨酰殘基。另外,還獲得了毛竹Phe-miR397的88bp前體序列。3.利用RLM-5'RACE技術(shù),驗證了Phe-miR397對PeLAC和PeLAC190具有切割作用,切割位點均位于靶點的第10-11位堿基之間。在毛竹不同高度筍中,Phe-miR397的表達與PeLAC、PeLAC190呈相反趨勢,進一步證明了Phe-miR397可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控PeLAC和PeLAC190的表達。PeLAC和PeLAC190在毛竹中為組成型表達,且均在莖里表達豐度最高,根中次之。NaCl(400 mmol·L 1)和ABA(100μmol·L-1)誘導PeLAC和PeLAC190的表達,而受GA3(100μmol·L-1)的抑制;CuSO4(5 mmol·L-1)對PeLAC190的表達影響不明顯,而抑制PeLAC,表明二者在激素信號轉(zhuǎn)導及響應逆境脅迫中可能發(fā)揮著重要作用。4.分別構(gòu)建Phe-miR397以及PeLAC和PeLAC190的過表達載體,采用浸花法轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥。結(jié)果表明,與野生型相比,PeLAC和PeLAC190轉(zhuǎn)基因植株均出現(xiàn)植株變小,葉柄變長的現(xiàn)象,莖木質(zhì)素含量增加;而Phe-miR397轉(zhuǎn)植株根系生長快。干旱處理條件下,PeLAC和PeLAC190轉(zhuǎn)基因植株抗旱性增強,Phe-miR397轉(zhuǎn)基因植株抗旱性減弱。酚酸處理后PeLAC和PeLAC190轉(zhuǎn)基因植株成活率高于野生型。由此表明,PhemiR397及其靶基因PeLAC、PeLAC190參與木質(zhì)素合成及非生物脅迫響應。5.構(gòu)建包含自身信號肽PeLAC的酵母表達載體,轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株GS115,在含有0.3 mmol·L-1 CuSO4和0.2 mmol·L-1 ABTS的MM平板上劃線培養(yǎng),經(jīng)甲醇誘導后呈現(xiàn)墨綠色,證明獲得陽性克隆。陽性克隆經(jīng)液體培養(yǎng)誘導,取上清進行SDS-PAGE檢測,結(jié)果顯示約在77 kDa有一條特異條帶,與預期融合蛋白相符。體外酶活分析表明,經(jīng)誘導48 h具有活性的PeLAC蛋白,活力最大為2.031 U·m L-1;酶促反應最適pH為4.0,溫度40℃。由此表明,利用畢赤酵母表達PeLAC能夠獲得具有生物活性的酶蛋白。本研究為揭示毛竹漆酶基因在木質(zhì)素合成及非生物脅迫中的功能提供了參考依據(jù),也為進一步利用基因工程手段來調(diào)控植物木質(zhì)素含量和抗逆育種提供了新的基因資源。
【學位授予單位】：中國林業(yè)科學研究院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S795.7

【參考文獻】

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本文編號：2577566