【摘要】：大花蕙蘭(Cymbidium hybridum)是以蘭科蘭屬植物為親本,通過雜交育種培育成的品種群,具有極高的觀賞價(jià)值和重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,為五大盆栽蘭花之一,是重要的切花種類之一。近年來,世界多種蘭花的栽培和生產(chǎn)受病毒危害嚴(yán)重,其中建蘭花葉病毒(Cymbidium mosaic virus,Cym MV)與齒蘭環(huán)斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)是造成危害最為嚴(yán)重的兩種重要病毒,可導(dǎo)致植株生長不良、花期縮短,開花質(zhì)量和數(shù)量下降,嚴(yán)重影響花卉的觀賞價(jià)值,制約了產(chǎn)業(yè)發(fā)展。因此,培育大花蕙蘭抗病毒新品種已成為育種的主要方向。由于蘭花抗病毒種質(zhì)資源的匾乏,育種周期漫長,導(dǎo)致蘭花抗病毒育種一直處于停滯狀態(tài),基因工程技術(shù)的應(yīng)用為其開辟了一條新的道路。本研究對建蘭花葉病毒與齒蘭環(huán)斑病毒的外殼蛋白基因進(jìn)行了克隆,分別構(gòu)建了2種病毒外殼蛋白基因的p BI121表達(dá)載體,采用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導(dǎo)法對大花蕙蘭進(jìn)行了轉(zhuǎn)化,獲得了轉(zhuǎn)基因再生植株。同時(shí),建立靈敏、準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)基因植株檢測方法。為利用基因工程技術(shù)進(jìn)行蘭花抗病毒育種提供了參考,為以后的蘭花新品種培育提供了種質(zhì)資源。1、本研究克隆了建蘭花葉病毒與齒蘭環(huán)斑病毒兩種病毒的外殼蛋白基因,Cym MV CP基因序列和ORSV CP基因序列與NCBI上的基因序列(AB197937,DQ915440)相似度均高達(dá)99%。2、構(gòu)建了Cym MV CP基因與ORSV CP基因的表達(dá)載體p BI121-Cym MVCP和p BI121-ORSVCP,通過農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)對大花蕙蘭受體材料進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。3、以表達(dá)載體p BI121-Cym MVCP和p BI121-ORSVCP為模板,建立了普通PCR、巢式P CR和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)檢測體系,并對LAMP體系中的d NTPs濃度、內(nèi)外引物的濃度比例和Bst DNA聚合酶加入量等條件進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化后的反應(yīng)條件為:0.5mmol·L-1 d NTPs、0.8μmol·L-1的內(nèi)引物、0.2μmol·L-1的外引物、4 U Bst DNA聚合酶大片段、2.5μL的10×Thermo Pol Buffer以及10 ng的質(zhì)粒模板。4、以重組表達(dá)載體質(zhì)粒作模板,普通PCR,巢式PCR和LAMP的最低檢出濃度分別為5.0×10-4 ng·μL-1,5.0×10-7 ng·μL-1和5.0×10-10 ng·μL-1;結(jié)果表明,巢式PCR方法的靈敏度是普通PCR方法的1000倍左右,而LAMP方法的靈敏度則是巢式PCR方法的1000倍,LAMP方法的靈敏度最高。5、利用普通PCR和巢式PCR兩種方法對獲得的213株抗性植株進(jìn)行檢測。其中,普通PCR檢出29株陽性株系,陽性檢出率為13.68%;巢式PCR檢出54株陽性株系(包含所有普通PCR檢測為陽性的株系),陽性檢出率為25.35%。巢式PCR在轉(zhuǎn)基因大花蕙蘭的檢測中具有高靈敏度,且檢測結(jié)果更準(zhǔn)確。
【學(xué)位授予單位】：中國林業(yè)科學(xué)研究院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S436.8

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本文編號：2526864