【摘要】：藥用植物遺傳轉化體系的建立對其功能基因研究具有重要意義,本研究在已有苦豆子再生體系的基礎上,分別對苦豆子愈傷組織的農桿菌(含pBI 121質粒)侵染濃度、侵染時間、愈傷組織與農桿菌的共培養(yǎng)時間、預培養(yǎng)時間、乙酰丁香酮(AS)添加方式和AS濃度進行研究,對這6個轉化因子進行優(yōu)化,探究各因素對苦豆子愈傷瞬時轉化的影響,以確立最佳的苦豆子瞬時轉化體系;在已有苦豆子賴氨酸脫羧酶基因(SaLDC)編碼區(qū)的基礎上,克隆得到該基因的啟動子序列,并對獲得的SaLDC啟動子進行生物信息學分析;通過在苦豆子愈傷組織中的GUS瞬時表達對SaLDC啟動子進行缺失分析,旨在確定該啟動子的核心區(qū)域和研究不同缺失片段啟動子對于下游基因的調控作用;農桿菌介導遺傳轉化擬南芥,獲得轉基因擬南芥植株,以探索SaLDC啟動子表達模式,為啟動子順式作用元件與相關轉錄因子的互作研究提供依據,研究結果如下:(1)建立并優(yōu)化了苦豆子瞬時轉化體系:預培養(yǎng)15 d的苦豆子愈傷組織,用菌液濃度A600=0.9農桿菌侵染15 min,農桿菌與愈傷組織共培養(yǎng)48 h,并在侵染液中添加AS 200 μmol·L-1時,瞬時轉化效率最高,可達83.33%。(2)以苦豆子基因組DNA為模板克隆獲得SaLDC上游1260 bp的啟動子序列,提交至NCBI,GenBank登錄號:KY038928。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)該啟動子片段含有基本順式元件TATA-box和CAAT-box,以及其它響應外界刺激的順式作用元件,包括生物響應元件:病原體響應元件;非生物響應元件:干旱響應元件、光響應元件、茉莉酸甲酯響應元件、逆境防御應答元件、組織表達特異性元件等,表明SaLDC基因可能通過響應外界生物或非生物脅迫影響賴氨酸脫羧酶的表達。(3)將不同長度(310、594、765、924和1260bp)的啟動子缺失片段分別與GUS報告基因融合,構建植物表達載體(依次命名為P310、P594、P765、P924和P1260),經農桿菌介導轉化苦豆子愈傷組織,GUS瞬時表達結果顯示,5個不同長度的SaLDC啟動子片段均可驅動GUS基因在苦豆子愈傷組織中的表達,表明克隆所得的不同長度SaLDC啟動子序列片段均具有啟動活性,但表達水平具有顯著差異,以310 bp啟動子片段GUS瞬時表達強度最高,并隨著SaLDC啟動子片段長度的增加,GUS瞬時表達的強度逐漸下降。(4)對轉基因(p1260)T2代擬南芥干旱和光照脅迫發(fā)現(xiàn),SaLDC啟動子為誘導型啟動子,干旱和光照均可誘導GUS基因表達上調;:SaLDC啟動子在轉基因擬南芥中有效驅動GUS基因在葉片和花萼中優(yōu)勢表達,具有組織表達特異性:SaLDC啟動子在轉基因南芥幼苗期的不同生長階段均可檢測到GUS活性,但表達水平存在差異,表達水平隨擬南芥的生長有下降趨勢,具有時空表達特異性。
【圖文】：

ＤＮＡ為模板擴增啟動子序列，用１．０％瓊脂糖凝膠電泳２）。逡逑Ｍ邋１邐２逡逑■逡逑２０００ｂｐ邋■寺邋ｐ邋Ａ邋（逡逑ｌＯＯＯｂｐ邐：；逡逑５００ｂｐ逡逑１邋ＯＯｂｐ—？邋Ｉ邋＾邐＾逡逑圖３－２邋＆ＬＤＣ啟動子瓊脂糖凝膠電泳逡逑Ｍ：邋ＤＬ２０００邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ；邋１、２：邐啟動子片段逡逑序歹ＩＪ連接轉化及測序逡逑Ｍ１２３４５６７８逡逑

第三章ＳａＬＤＣ啟動子液體培養(yǎng)基，２８°Ｃ，，ＳＯＯｒｐｍ．ｍｉｎ－１，菌液，倒掉部分上清，輕彈離心管重的菌體涂布于附加５０邋ｍｇｌ－１卡那霉素培養(yǎng)４８邋ｈ；逡逑ＣＲ和雙酶切驗證。逡逑隆逡逑板擴增啟動子序列，用１．０％瓊脂糖凝Ｍ邋１邐２逡逑
【學位授予單位】：寧夏大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S567.23;Q943.2

【參考文獻】

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本文編號：2523167