本文關(guān)鍵詞：PID1對豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞增殖和分化的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：磷酸酪氨酸互作結(jié)構(gòu)域1(Phosphotyrosine interaction domain containing 1, PID1)是一個(gè)近期發(fā)現(xiàn)的在肥胖者腹膜后脂肪組織中高表達(dá)的基因,后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)該基因參與胰島素抵抗,并且可能與脂質(zhì)代謝有關(guān)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),不同肌內(nèi)脂肪含量的豬PID1表達(dá)量與肌內(nèi)脂肪的沉積呈顯著正相關(guān)。因此,PID1可能是影響肌內(nèi)脂肪沉積的候選基因。本研究以豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞為研究對象,探討PID1基因?qū)ωi肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞增殖和分化的影響,主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下：1.豬PIDl基因原核表達(dá)、純化、多克隆抗體制備及組織表達(dá)譜分析以pET28a(+)為載體,大腸桿菌BL21(DE3)為宿主菌表達(dá)豬.PID1基因CDS區(qū)和組氨酸標(biāo)簽融合的重組蛋白。SDS-PAGE顯示表達(dá)出的蛋白分子量約32 kDa,經(jīng)過表達(dá)條件的優(yōu)化,重組蛋白能夠在30。C、經(jīng)0.1mmol/LIPTG誘導(dǎo)4h得到高效表達(dá),表達(dá)量達(dá)到宿主菌總蛋白的60%。溶解性分析表明重組蛋白主要以包涵體形式存在。包涵體使用6 mol/L鹽酸胍溶解后,使用親和層析法進(jìn)行純化,最終重組蛋白濃度達(dá)到了1.6mg/mL,并且SDS-PAGE檢測可見單一條帶。對純化后的蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,結(jié)果表明純化的重組蛋白為豬PID1蛋白。重組蛋白經(jīng)稀釋法復(fù)性后處理增殖中的3T3-L1前體脂肪細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)該蛋白能促進(jìn)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞增殖,表明復(fù)性后的蛋白具有生物學(xué)活性。另外,本研究用純化后的蛋白多次免疫SD大鼠的方法制備多克隆抗體。多克隆抗體的效價(jià)和特異性分別用間接酶聯(lián)免疫反應(yīng)和Western Blot鑒定。ELISA結(jié)果表明,制備的多克隆抗體滴度達(dá)1：20480；Western Blot結(jié)果顯示該多克隆抗體能夠特異性識(shí)別PID1蛋白,表明多克隆抗體制備成功,這將為研究PID1的功能提供一個(gè)很好的工具。以10周齡DLY豬為研究對象,使用自制的多克隆抗體檢測了PIDl基因在腰大肌、趾長伸肌、脂肪、背最長肌、腎、肺、脾、肝臟和心臟中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)PID1蛋白主要表達(dá)于肌肉組織,其次是肝臟。這表明PID1可能影響脂質(zhì)代謝,尤其可能影響肌肉組織中脂質(zhì)代謝。因此,PID1可能是影響肌內(nèi)脂肪沉積的候選基因。2.PID1對豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞增殖和分化的影響哺乳動(dòng)物肌內(nèi)脂肪的80%以上存儲(chǔ)于肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中,因此本試驗(yàn)探討了PID1對豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞增殖和分化的影響。首先,采用差數(shù)貼壁法從3日齡DLY豬背最長肌中分離肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞,免疫熒光檢測前脂肪細(xì)胞特異性基因Pref-1的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)幾乎100%細(xì)胞表達(dá)Pref-1:同時(shí)油紅O染色結(jié)果顯示本試驗(yàn)分離的細(xì)胞能夠分化為成熟脂肪細(xì)胞。其次,采用添加豬PID1重組蛋白和轉(zhuǎn)染PID1過表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-pPID1兩種方法,探討PID1對豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組豬PID1蛋白處理以及轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-pPID1均能促進(jìn)豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的增殖。最后,為了研究PID1對豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化的影響,處理組細(xì)胞轉(zhuǎn)染0.5 μg pcDNA3.1(+)-pPID 1,對照組轉(zhuǎn)染等量的pcDNA3.1(+),誘導(dǎo)分化8 d之后檢測脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果表明PID1過表達(dá)顯著上調(diào)脂肪細(xì)胞分化主要轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα、PPARγ的mRNA水平和蛋白水平,并且顯著上調(diào)脂肪細(xì)胞分化早期標(biāo)志基因LPL的mRNA水平,這表明PID1能促進(jìn)豬肌內(nèi)前體脂肪的分化。綜上所述,本研究首次用原核表達(dá)系統(tǒng)、親和層析純化以及稀釋復(fù)性的方法制備了具有生物學(xué)活性的豬PID1重組蛋白及其多克隆抗體；用制備的多克隆抗體檢測豬PID1組織表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)PID1蛋白主要表達(dá)于肌肉組織和肝臟,表明PID1可能是影響肌內(nèi)脂肪沉積的候選基因；通過轉(zhuǎn)染豬PID1重組質(zhì)�；蛱砑迂iPID1重組蛋白于豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞,探討PID1對豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞增殖和分化的影響,首次提供了PID1促進(jìn)豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞增殖和分化的依據(jù)。

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