本文關鍵詞：PID1對豬肌內前體脂肪細胞增殖和分化的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：磷酸酪氨酸互作結構域1(Phosphotyrosine interaction domain containing 1, PID1)是一個近期發(fā)現(xiàn)的在肥胖者腹膜后脂肪組織中高表達的基因,后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)該基因參與胰島素抵抗,并且可能與脂質代謝有關。相關性分析發(fā)現(xiàn),不同肌內脂肪含量的豬PID1表達量與肌內脂肪的沉積呈顯著正相關。因此,PID1可能是影響肌內脂肪沉積的候選基因。本研究以豬肌內前體脂肪細胞為研究對象,探討PID1基因對豬肌內前體脂肪細胞增殖和分化的影響,主要研究內容及結果如下：1.豬PIDl基因原核表達、純化、多克隆抗體制備及組織表達譜分析以pET28a(+)為載體,大腸桿菌BL21(DE3)為宿主菌表達豬.PID1基因CDS區(qū)和組氨酸標簽融合的重組蛋白。SDS-PAGE顯示表達出的蛋白分子量約32 kDa,經過表達條件的優(yōu)化,重組蛋白能夠在30。C、經0.1mmol/LIPTG誘導4h得到高效表達,表達量達到宿主菌總蛋白的60%。溶解性分析表明重組蛋白主要以包涵體形式存在。包涵體使用6 mol/L鹽酸胍溶解后,使用親和層析法進行純化,最終重組蛋白濃度達到了1.6mg/mL,并且SDS-PAGE檢測可見單一條帶。對純化后的蛋白進行質譜鑒定,結果表明純化的重組蛋白為豬PID1蛋白。重組蛋白經稀釋法復性后處理增殖中的3T3-L1前體脂肪細胞,發(fā)現(xiàn)該蛋白能促進3T3-L1前體脂肪細胞增殖,表明復性后的蛋白具有生物學活性。另外,本研究用純化后的蛋白多次免疫SD大鼠的方法制備多克隆抗體。多克隆抗體的效價和特異性分別用間接酶聯(lián)免疫反應和Western Blot鑒定。ELISA結果表明,制備的多克隆抗體滴度達1：20480；Western Blot結果顯示該多克隆抗體能夠特異性識別PID1蛋白,表明多克隆抗體制備成功,這將為研究PID1的功能提供一個很好的工具。以10周齡DLY豬為研究對象,使用自制的多克隆抗體檢測了PIDl基因在腰大肌、趾長伸肌、脂肪、背最長肌、腎、肺、脾、肝臟和心臟中的表達情況,發(fā)現(xiàn)PID1蛋白主要表達于肌肉組織,其次是肝臟。這表明PID1可能影響脂質代謝,尤其可能影響肌肉組織中脂質代謝。因此,PID1可能是影響肌內脂肪沉積的候選基因。2.PID1對豬肌內前體脂肪細胞增殖和分化的影響哺乳動物肌內脂肪的80%以上存儲于肌內脂肪細胞中,因此本試驗探討了PID1對豬肌內前體脂肪細胞增殖和分化的影響。首先,采用差數(shù)貼壁法從3日齡DLY豬背最長肌中分離肌內前體脂肪細胞,免疫熒光檢測前脂肪細胞特異性基因Pref-1的表達,結果發(fā)現(xiàn)幾乎100%細胞表達Pref-1:同時油紅O染色結果顯示本試驗分離的細胞能夠分化為成熟脂肪細胞。其次,采用添加豬PID1重組蛋白和轉染PID1過表達載體pcDNA3.1(+)-pPID1兩種方法,探討PID1對豬肌內前體脂肪細胞增殖的影響。結果發(fā)現(xiàn)重組豬PID1蛋白處理以及轉染pcDNA3.1(+)-pPID1均能促進豬肌內前體脂肪細胞的增殖。最后,為了研究PID1對豬肌內前體脂肪細胞分化的影響,處理組細胞轉染0.5 μg pcDNA3.1(+)-pPID 1,對照組轉染等量的pcDNA3.1(+),誘導分化8 d之后檢測脂肪細胞分化相關基因的表達。結果表明PID1過表達顯著上調脂肪細胞分化主要轉錄因子C/EBPα、PPARγ的mRNA水平和蛋白水平,并且顯著上調脂肪細胞分化早期標志基因LPL的mRNA水平,這表明PID1能促進豬肌內前體脂肪的分化。綜上所述,本研究首次用原核表達系統(tǒng)、親和層析純化以及稀釋復性的方法制備了具有生物學活性的豬PID1重組蛋白及其多克隆抗體；用制備的多克隆抗體檢測豬PID1組織表達情況,發(fā)現(xiàn)PID1蛋白主要表達于肌肉組織和肝臟,表明PID1可能是影響肌內脂肪沉積的候選基因；通過轉染豬PID1重組質�；蛱砑迂iPID1重組蛋白于豬肌內前體脂肪細胞,探討PID1對豬肌內前體脂肪細胞增殖和分化的影響,首次提供了PID1促進豬肌內前體脂肪細胞增殖和分化的依據(jù)。

  本文關鍵詞：PID1對豬肌內前體脂肪細胞增殖和分化的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。