【摘要】：煙曲霉菌(Aspergillus fumigatus,A.fumigatus)是一種腐生性霉菌,分布于潮濕的土壤、動(dòng)物墊料以及霉變飼料中。許多研究指出,煙曲霉菌在禽舍環(huán)境中廣泛存在,以孢子的形式分布于空氣中,被禽類吸入后能夠到達(dá)呼吸道深部和肺,引起呼吸道疾病。目前,煙曲霉菌的研究重點(diǎn)集中在臨床病例的診斷、防治以及哺乳動(dòng)物宿主的致病機(jī)制方面,但其感染禽類誘導(dǎo)的先天性免疫尚未見報(bào)道,而且,關(guān)于煙曲霉菌與細(xì)菌和病毒繼發(fā)感染后的先天性免疫反應(yīng)亦未見研究。本課題首先建立雛雞的煙曲霉菌人工感染模型,檢測(cè)了模型動(dòng)物靶器官和主要淋巴器官的先天性免疫因子的表達(dá),在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了煙曲霉菌人工繼發(fā)大腸桿菌、H9N2禽流感感染,從發(fā)病率、靶器官載菌量(載毒量)以及先天性免疫指標(biāo)等方面檢測(cè)真菌感染后,繼發(fā)感染細(xì)菌和病毒的及先天性免疫受體、相關(guān)免疫因子的表達(dá)。從先天性免疫的角度為真菌免疫以及真菌繼發(fā)其他病原感染提供一定的參考。本研究分為以下3部分內(nèi)容:一、雛雞人工感染煙曲霉菌模型的建立用皮下注射、灌服、氣管滴注、氣囊注射四種感染途徑及分別為0.1m L、0.5 m L、1.0 mL的劑量感染14日齡雛雞,通過臨床癥狀、剖檢變化和死亡率,確定雛雞人工感染煙曲霉菌的最佳感染途徑為胸部氣囊注射,最佳感染劑量為0.1mL濃度為107CFU/mL的孢子懸液,成功建立雛雞人工感染煙曲霉菌模型。二、雛雞感染煙曲霉菌后誘發(fā)的先天性免疫反應(yīng)為闡明雛雞感染煙曲霉菌過程中誘導(dǎo)的先天性免疫反應(yīng),利用熒光定量PCR法檢測(cè)肺、脾中四種Toll樣受體(TLR1、TLR2、TLR4、TLR7)、6種細(xì)胞因子(Cxcl-8、IL-6、IFN-α、IFN-β、TNF-α)和2種主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I、MHC-Ⅱ)在mRNA水平的表達(dá)。將30只14日齡SPF雛雞隨機(jī)分為兩組:煙曲霉菌感染組和試驗(yàn)對(duì)照組,分別在感染后第1、3、5、7天取兩組的脾、肺組織。結(jié)果表明,3dpi時(shí)肺、脾中TLR1、TLR2、TLR7的表達(dá)顯著高于對(duì)照組(p0.05);Cxcl-8、IL-6、IFN-α均在3dpi肺、脾中上調(diào)顯著(p0.05),其中,Cxcl-8在肺中上調(diào)倍數(shù)最大,可達(dá)到33.9倍。5dpi時(shí)肺、脾中MHC-I和MHC-Ⅱ的表達(dá)顯著高于對(duì)照組(p0.05),MHC-I的上調(diào)倍數(shù)可達(dá)到21.7倍。由此可以看出,TLR1、RLR2、TLR7在識(shí)別煙曲霉菌過程中發(fā)揮重要作用,Cxcl-8和MHC-I也能起到主要的效應(yīng)能力。三、雛雞煙曲霉菌繼發(fā)感染大腸桿菌、H9N2的研究及其誘導(dǎo)的先天性免疫反應(yīng)應(yīng)答利用平板計(jì)數(shù)法對(duì)雛雞煙曲霉菌繼發(fā)感染大腸桿菌及大腸桿菌單純感染時(shí)心、肝、脾內(nèi)的細(xì)菌含量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,同時(shí)間段內(nèi)繼發(fā)感染組在三種組織中的細(xì)菌含量均顯著高于單純感染組(p0.05)。其中,繼發(fā)感染第1天,脾內(nèi)的大腸桿菌含量最高,可達(dá)到106 CFU/g,與單一感染組相比差異顯著(p0.05);繼發(fā)感染第2天,肝內(nèi)的細(xì)菌含量達(dá)到109 CFU/g,顯著高于單純感染組(p0.05)。此外,利用熒光定量PCR法,檢測(cè)雛雞繼發(fā)感染組及單純感染組,心、脾中的先天性免疫反應(yīng)。2dpi時(shí),繼發(fā)感染組心內(nèi)TLR4、IFN-β的表達(dá)量均顯著高于單純感染組(p0.05);繼發(fā)感染組脾內(nèi)TLR4、TLR2、IL-1β的表達(dá)量均顯著高于單純感染組(p0.05)。結(jié)果表明,宿主受到煙曲霉菌繼發(fā)大腸桿菌感染時(shí),TLRs及細(xì)胞因子更容易被激活。采用紅細(xì)胞血凝效價(jià)檢測(cè)方法對(duì)煙曲霉菌繼發(fā)感染H9N2組及單純感染H9N2時(shí)肺組織內(nèi)的毒力效價(jià)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,繼發(fā)感染組毒力效價(jià)均高于單純感染組的病毒毒力效價(jià)。在研究雛雞煙曲霉菌繼發(fā)感染H9N2及單純感染H9N2時(shí)誘導(dǎo)的先天性免疫反應(yīng)中,2dpi時(shí)繼發(fā)感染組雛雞在肺和脾中TLR3、TLR7、IL-1β的表達(dá)量均比單純H9N2感染組顯著上升(p0.05)。其中,TLR3和TLR7在兩組雛雞的肺中表達(dá)趨勢(shì)相似,起初的表達(dá)量不明顯,隨著時(shí)間的推移而逐漸上調(diào)。3dpi時(shí)繼發(fā)感染組脾、肺中IFN-β的表達(dá)量達(dá)到峰值,且差異顯著(p0.05)。由此看出,宿主先受到煙曲霉菌感染,H9N2更易入侵機(jī)體,引發(fā)的TLRs及細(xì)胞因子應(yīng)答更強(qiáng)烈。本實(shí)驗(yàn)初步研究了雛雞受到煙曲霉菌感染后誘導(dǎo)的先天性免疫反應(yīng),煙曲霉菌繼發(fā)感染大腸桿菌、H9N2的研究,為霉菌固有免疫的深入研究做了鋪墊。
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【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S858.31

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2417629