【摘要】：抗脂多糖因子(Anti-lipopolysaccharide factor,ALF)是甲殼動(dòng)物體內(nèi)主要的抗菌肽分子,屬于陽(yáng)離子抗菌肽家族。該家族抗菌肽具有序列和功能多樣性的特點(diǎn),在抗細(xì)菌、真菌、病毒等免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。目前,對(duì)于該類抗菌肽如何通過(guò)序列的多樣性影響其功能的多樣性,仍缺乏足夠的了解。本研究論文從擬穴青蟹體內(nèi)鑒定了2種非典型的抗脂多糖因子成員,通過(guò)序列分析和功能研究,初步闡明了ALF家族成員序列多樣性和其免疫功能的關(guān)系,揭示了序列多樣性對(duì)功能多樣的性的影響規(guī)律。我們研究首先從擬穴青蟹體內(nèi)鑒定了SpALF6及其變異體SpALF6-V。與該家族大多成員蛋白屬于陽(yáng)離子抗菌肽不同,SpALF6的pI值為6.79,其LPS結(jié)合結(jié)構(gòu)域LBD(LPS-binding domain)pI值為6.05,屬于非典型的ALF家族成員,而其自然界中變異體SpALF6-V的pI值卻為7.98,屬于陽(yáng)離子抗菌肽。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),這個(gè)變異體的產(chǎn)生是源于特定位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性(SNP)。為了研究SNP位點(diǎn)的存在對(duì)蛋白質(zhì)功能的影響,我們對(duì)這兩個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)氨基酸的突變分別是SpALF6成熟肽的LBD附近帶正電荷組氨酸突變成高電荷精氨酸(H46突變?yōu)镽),遠(yuǎn)離LBD的丙氨酸突變成了脯氨酸(A110突變?yōu)镻)。由于丙氨酸和脯氨酸都不帶電荷,而且遠(yuǎn)離LPS結(jié)合域,因此我們認(rèn)為突變體SpALF6-V與SpALF6的性質(zhì)功能上的差異可能是由組氨酸的突變導(dǎo)致的,因此為了研究這兩種抗菌肽功能上的差異,我們通過(guò)人工定點(diǎn)突變的技術(shù)僅將組氨酸突變成了精氨酸獲得了SpALF6的人工突變體來(lái)模擬SpALF6-V的功能,命名為SpALF6-M。首先我們進(jìn)行了SpALF6在體內(nèi)組織分布和表達(dá)模式研究。隨后我們進(jìn)行了SpALF6、SpALF6-M體外抑菌實(shí)驗(yàn),細(xì)菌結(jié)合實(shí)驗(yàn)以及微生物表面主要病原相關(guān)分子模式結(jié)合實(shí)驗(yàn)比較研究。此外,我們也人工合成了SpALF6的LBD肽對(duì)其保守區(qū)進(jìn)行了抑菌活性和微生物表面多糖結(jié)合研究。組織分布和表達(dá)模式研究結(jié)果表明,SpALF6主要是在血淋巴中表達(dá),副溶血弧菌和金黃色葡萄球菌免疫刺激青蟹后可以導(dǎo)致SpALF6的上調(diào)表達(dá),暗示SpALF6可能參與到了抑菌免疫應(yīng)答。與SpALF6相比,SpALF6-M表現(xiàn)出了更強(qiáng)抗革蘭氏陽(yáng)性菌和真菌作用以及細(xì)菌結(jié)合活性。同時(shí),SpALF6-M也表現(xiàn)出了更強(qiáng)的LTA的結(jié)合活性,暗示SpAFL6-LBD外部且距離該結(jié)構(gòu)域較近的特定氨基酸的能協(xié)助增強(qiáng)蛋白的抗菌作用。SpAFL6-LBD肽的功能研究結(jié)果表明,SpAFL6-LBD肽可以結(jié)合LPS、LTA、PGN等多糖,而且活性更強(qiáng),表明該保守區(qū)域仍是活性中心,但是該陰離子短肽并沒(méi)有表現(xiàn)出抑菌作用,暗示著其發(fā)揮抑菌作用仍需要LBD附近的氨基酸參與。我們研究還鑒定了SpALF7,通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),與經(jīng)典的ALF蛋白家族具有3個(gè)α-螺旋和4個(gè)β-折疊,并且依靠2個(gè)半胱氨酸形成1個(gè)二硫鍵維持核心功能域的三維結(jié)構(gòu)不同,蛋白序列及結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示,SpALF7只含有2個(gè)α-螺旋和4個(gè)β-折疊,并且該序列含有4個(gè)半胱氨酸,可能形成2個(gè)二硫鍵。對(duì)其組織分布和抗菌功能進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)SpALF7主要表達(dá)在血細(xì)胞;重組蛋白SpALF7體外抑菌功能研究發(fā)現(xiàn)SpALF7對(duì)除嗜水氣單孢菌以外革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌以及真菌生長(zhǎng)都有不同程度的抑制作用。SpALF7的細(xì)菌結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,SpALF7與副溶血弧菌、酵母菌和氣單胞菌結(jié)合活性較強(qiáng),而與金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和白色念珠球菌結(jié)合活性較弱。微生物多糖結(jié)合實(shí)驗(yàn)顯示,SpALF7可結(jié)合LPS,對(duì)金黃色葡萄球菌PGN、LTA和真核生物細(xì)胞壁組分β-葡聚糖也有一定的結(jié)合活性,暗示SpALF7的抗菌功能與其糖結(jié)合能力密切相關(guān),可能利用與特定糖組分的結(jié)合,促進(jìn)隨后的抑菌功能。通過(guò)上述研究,本論文明確了SpALF6和SpALF7在青蟹免疫體系中發(fā)揮重要作用,闡明了兩個(gè)抗菌肽的主要序列特征、抗菌特性及可能的抗菌機(jī)理,進(jìn)一步揭示了ALF類分子抗菌活性與序列多態(tài)性之間的關(guān)系,具有重要的理論價(jià)值。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)SpALF6和SpALF7對(duì)多重耐藥的水產(chǎn)養(yǎng)殖弧菌具有明顯的殺菌效果,顯示了良好的應(yīng)用前景。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2414751