【摘要】：細(xì)胞色素P450(cytochrome P450或CYP450)是由許多同工酶組成的人和動(dòng)物體內(nèi)重要的藥物代謝酶超家族,涉及內(nèi)源性和外源性物質(zhì)以及幾乎所有藥物和其衍生物的代謝,另一方面,內(nèi)源性物質(zhì)以及外源性物質(zhì)同樣能夠影響細(xì)胞色素P450酶的表達(dá)。CYP2C33是豬體內(nèi)重要的藥物代謝酶之一,是人CYP2C家族的研究模型。IL-6(interleukin-6)是一種引起肝臟炎癥反應(yīng)以及腫瘤病變最重要的細(xì)胞因子之一,且IL-6具有免疫調(diào)節(jié)作用,作為免疫佐劑和免疫增強(qiáng)劑被應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)中。但其對(duì)相關(guān)藥物代謝酶表達(dá)的影響并不清楚,而藥物代謝酶表達(dá)的變化嚴(yán)重影響臨床藥物的療效、毒性作用以及藥物與藥物間的相互作用。本研究首次探討豬IL-6對(duì)CYP2C33的表達(dá)調(diào)控及其相關(guān)的分子機(jī)制,為IL-6對(duì)CYP450表達(dá)調(diào)控研究提供理論基礎(chǔ),同時(shí)為獸醫(yī)及臨床醫(yī)學(xué)上的合理用藥提供理論指導(dǎo)。1.各種不同細(xì)胞色素P450在組織中的分布用qRT-PCR的方法檢測(cè)不同組織中(心、肝、腎臟、小腸、肌肉、脾臟、皮膚、肺)細(xì)胞色素P450 m RNA的分布情況,結(jié)果顯示,肝臟中CYP1A,CYP2C,CYP2D,CYP2E,CYP3A m RNA水平明顯高于其他組織,而肝臟中含量最高的是CYP3A類(lèi)藥物代謝酶,其次則為CYP2C。該實(shí)驗(yàn)證明I相代謝主要集中于肝臟組織,因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平研究細(xì)胞色素P450應(yīng)在肝臟原代細(xì)胞水平和肝臟傳代細(xì)胞水平研究。而在肝臟中含量最高的則是CYP3A類(lèi)及CYP2C類(lèi)藥物代謝酶,這為后續(xù)的研究提供了一定的基礎(chǔ)。2.原代豬肝細(xì)胞的分離培養(yǎng)利用不同方法獲得了高活性的豬原代肝細(xì)胞,最終確定其最佳的方法為:采用PBE,PB,PBC三步灌流方法,最佳膠原酶灌流濃度為0.05%,最佳的包被方式為鼠尾膠原包被法。通過(guò)實(shí)驗(yàn)獲得的豬肝細(xì)胞高達(dá)3X109個(gè),存活率99.9%,細(xì)胞在培養(yǎng)5小時(shí)后開(kāi)始貼壁分化,并在12小時(shí)細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定,有較好的結(jié)構(gòu)功能,通過(guò)測(cè)定相關(guān)藥物代謝酶的m RNA水平與肝組織的較為相近,可用于IL-6的研究。3.IL-6在細(xì)胞水平對(duì)豬細(xì)胞色素酶CYP2C33表達(dá)的影響為了檢測(cè)IL-6對(duì)豬細(xì)胞色素酶CYP2C33表達(dá)的影響,在不同時(shí)間點(diǎn)用不同濃度梯度的IL-6作用豬原代肝細(xì)胞和傳代細(xì)胞系Hep Li,應(yīng)用q RT-PCR和Western-blot的方法檢測(cè)了肝臟細(xì)胞中IL-6對(duì)CYP2C33的表達(dá)量的影響,結(jié)果顯示IL-6能顯著性上調(diào)CYP2C33的表達(dá),并呈現(xiàn)一定的時(shí)間和劑量相關(guān)性。4.IL-6從轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)CYP2C33表達(dá)調(diào)控通過(guò)轉(zhuǎn)錄抑制實(shí)驗(yàn),證明了IL-6是從轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)CYP2C33的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控的。構(gòu)建含有不同長(zhǎng)度CYP2C33啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒,通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同長(zhǎng)度的CYP2C33啟動(dòng)子片段,發(fā)現(xiàn)CYP2C33的核心啟動(dòng)子區(qū)域位于CYP2C33轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-2424到-1593區(qū)域,并且下游第一個(gè)內(nèi)含子區(qū)域?qū)ι嫌螁?dòng)子活性有一定的增強(qiáng)作用,通過(guò)用IL-6刺激其核心啟動(dòng)子區(qū)域,發(fā)現(xiàn)IL-6能激活CYP2C33的核心啟動(dòng)子區(qū)域。因此提示IL-6對(duì)CYP2C33的表達(dá)調(diào)控是從轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)其發(fā)揮作用的。5.IL-6對(duì)核受體PXR,CAR,RXR-α表達(dá)的影響分別用不同濃度的IL-6在不同時(shí)間分別作用豬原代肝細(xì)胞和傳代細(xì)胞系Hep Li,應(yīng)用q RT-PCR和Western-blot檢測(cè)了肝臟細(xì)胞中核受體PXR,CAR,RXR-α的表達(dá)量的影響,結(jié)果顯示IL-6對(duì)RXR-α的表達(dá)并沒(méi)有顯著影響。而IL-6能顯著性上調(diào)CAR和PXR的表達(dá),CAR和PXR的變化趨勢(shì)與CYP2C33變化趨勢(shì)有相關(guān)性,且呈現(xiàn)一定的時(shí)間和劑量相關(guān)性。6.IL-6對(duì)CYP2C33表達(dá)機(jī)制的研究通過(guò)RACE的方法獲得全長(zhǎng)的RXR-α的序列,構(gòu)建PXR,CAR以及RXR-α的真核表達(dá)質(zhì)粒,用細(xì)胞轉(zhuǎn)染PXR,CAR和RXR-α的真核表達(dá)質(zhì)粒以及si PXR,si CAR,si RXR-α超表達(dá)或干擾相關(guān)核受體的表達(dá),探討IL-6上調(diào)CYP2C33表達(dá)的分子機(jī)制。結(jié)果顯示:超表達(dá)PXR以及干擾PXR表達(dá)后,CYP2C33的表達(dá)并沒(méi)有顯著變化,而超表達(dá)CAR和RXR-α以及干擾CAR和RXR-α表達(dá)后CYP2C33的表達(dá)有相應(yīng)的變化。因此提示IL-6上調(diào)CYP2C33表達(dá)與核受體CAR和RXR-α相關(guān)。
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【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S859.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2384057