本文關(guān)鍵詞：對(duì)蝦白斑綜合征病毒囊膜蛋白VP28和VP26與細(xì)胞穿膜肽的融合蛋白在畢赤酵母中的組成型表達(dá)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《安徽醫(yī)科大學(xué)》 2016年

長效GLP-1-IgG2σ Fc融合蛋白的真核表達(dá)與生物活性鑒定

楊懿  

【摘要】：GLP-1(Glucagon-like peptide-1,胰高血糖素樣肽)是一種由胰高血糖素原基因翻譯表達(dá)的一種31個(gè)氨基酸的多肽,它通過與相應(yīng)的G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合發(fā)揮生物效應(yīng)。GLP-1可以顯著的提高一、二相胰島素分泌,降低胰高血糖素水平,并延緩胃排空,因?yàn)镚LP-1降低血糖的效應(yīng)具有血糖依賴性并且具有降低體重的作用,故GLP-1作為二型糖尿病的治療藥物時(shí)可以有效的避免低血糖的發(fā)生并緩解肥胖所造成的胰島素耐受。由于體內(nèi)二肽基肽酶對(duì)于GLP-1的特異性酶切和小分子多肽固有的高腎清除率,GLP-1體內(nèi)半衰期僅僅為2分鐘。當(dāng)前研究主要采用對(duì)GLP-1氨基酸位點(diǎn)修飾、替換和連接大分子蛋白的方法來為了延長GLP-1的半衰期。具有代表性的GLP-1類似物有Exenatide(艾塞那肽)、Liraglutide(利拉魯肽)和Dulaglutide (杜拉魯肽)。本課題中將GLP-1變體(A8G/G26E/R36G)通過肽鏈Linker連接在IgG2σ的Fc段上。利用CHO-K1甫乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)平臺(tái)構(gòu)建并表達(dá)了GLP-1 IgG2σFc融合蛋白。通過初步親和層析獲得了純度較高的重組融合蛋白,并在體內(nèi)和體外水平對(duì)GLP-1 Fc融合蛋白進(jìn)行了生物活性鑒定。第一部分構(gòu)建GLP-1-IgG2σ Fc融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒并篩選出穩(wěn)定表達(dá)GLP-1-IgG2σ Fc融合蛋白的CHO-K1穩(wěn)定細(xì)胞株本部分研究將設(shè)計(jì)合成的GLP-1 IgG2σ Fc融合蛋白編碼序列(cDNA,918bp)使用T4連接酶酶連入哺乳細(xì)胞表達(dá)載體SGLs載體中(7956bp),并通過測序確認(rèn)表達(dá)載體構(gòu)建成功(引物5'-CAGGACCACGTCGTGCCAGT-3')。在使用PvuI酶對(duì)表達(dá)載體酶切后,使用電穿孔轉(zhuǎn)染的方式將線性化表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至CHO-K1細(xì)胞中,使用蛋白凝膠電泳和間接法ELISA對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行檢測,篩選出高表達(dá)細(xì)胞株。經(jīng)過三輪的亞克隆篩選最終獲得的細(xì)胞株蛋白表達(dá)水平達(dá)到1.2g/L。通過對(duì)連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞上清進(jìn)行檢測,并根據(jù)目標(biāo)蛋白表達(dá)水平和雜質(zhì)含量變化,在細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)12天后收獲培養(yǎng)上清。該部分研究成功構(gòu)建了GLP-1-IgG2σ Fc融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒,構(gòu)建并篩選出融合蛋白的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。第二部分建立GLP-1-IgG2σ Fc融合蛋白的純化方法并對(duì)融合蛋白進(jìn)行鑒定分析本部分研究的目的為探究從細(xì)胞培養(yǎng)上清中獲得純度較高融合蛋白的純化方法,并鑒定產(chǎn)物是否為目標(biāo)產(chǎn)物。首先通過離心收集細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)12天后的細(xì)胞上清,使用Protein A親和層析柱進(jìn)行親和層析,由于親和層析后的蛋白仍然含有降解產(chǎn)物和多聚體,因此進(jìn)一步進(jìn)行疏水層析,經(jīng)兩步純化獲得的融合蛋白,經(jīng)HPLC分析和SDS-PAGE分析,顯示蛋白純度高于90%。分別以抗GLP-1抗體和抗IgG Fc抗體為檢測抗體,對(duì)純化獲得的GLP-1-IgG2σ Fc融合蛋白進(jìn)行Western-blotting檢測,驗(yàn)證了融合蛋白的完整性。第三部分GLP-1-IgG2σ Fc融合蛋白的生物活性的體內(nèi)外研究本部分內(nèi)容中,首先通過INS-1細(xì)胞中進(jìn)行了GSIS(葡萄糖刺激胰島素分泌試驗(yàn)),胰島素ELISA測定證實(shí)GLP-1-IgG2σ Fc融合蛋白在高糖條件下可以促進(jìn)胰島素的分泌;同時(shí)通過熒光定量PCR檢測胰島素mRNA,也證實(shí)了融合蛋白具有促進(jìn)胰島素mRNA合成的作用。隨后,通過C57/BL6J小鼠OGTT試驗(yàn),一方面確定融合蛋白具有降血糖作用,一方面初步確立了給藥劑量。在自發(fā)性肥胖糖尿病模型KKAy小鼠體內(nèi)進(jìn)行為期四周(給藥頻率為每三天給藥一次)的實(shí)驗(yàn),與陽性對(duì)照藥GLP-1-IgG4 Fc融合蛋白相比,GLP-1-IgG2σ Fc融合蛋白顯示出更為出色的降血糖作用以及體重控制效能。最后在食蟹猴體內(nèi)進(jìn)行了的半衰期測定試驗(yàn),單次給藥0.1 mg/kg后,GLP-1-IgG2σ Fc融合蛋白的半衰期為57.1小時(shí),與Dulaglutide同實(shí)驗(yàn)體系下的半衰期(38小時(shí))相比,延長了約50%,初步驗(yàn)證了融合蛋白在保持GLP-1藥效的同時(shí),因融合低免疫活性IgG2σ Fc而獲得更長半衰期的設(shè)計(jì)理念。綜上所述,本課題成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)GLP-1-IgG2σFc融合蛋白的高表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株,經(jīng)純化制備了重組GLP-1-IgG2σFc融合蛋白,并考察了重組蛋白的體內(nèi)、外生物活性。結(jié)果表明重組GLP-1-IgG2σFc融合蛋白具備持久的降血糖作用、半衰期長及出色的體重控制能力,值得進(jìn)一步開發(fā)成為新的糖尿病治療藥物。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R96
【目錄】：

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