【摘要】：二十世紀(jì)90年代,我國(guó)首次報(bào)道了豬繁殖與呼吸綜合征(Procine reproductive and respirator syndrome,PRRS),并且確定其病原為美洲型PRRSV,直到現(xiàn)在該病仍然是影響我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)最主要的疾病之一。從爆發(fā)以來(lái),我國(guó)主要以美洲型高致病性PRRSV及其變異株為主。近些年,PRRS已經(jīng)打破了地域的限制,在我國(guó)北京、香港、內(nèi)蒙古等地相繼分離出歐洲型PRRSV,增加了我國(guó)對(duì)PRRS預(yù)防與治療難度。目前為止,還沒(méi)有專(zhuān)門(mén)針對(duì)我國(guó)境內(nèi)歐洲型PRRS的疫苗。本研究中,對(duì)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的歐洲型PRRS重組腺病毒疫苗進(jìn)行鑒定,利用生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)歐洲型PRRS重組腺病毒候選疫苗進(jìn)行擴(kuò)增,并通過(guò)動(dòng)物替代模型試驗(yàn)及血清學(xué)替代實(shí)驗(yàn),對(duì)重組腺病毒候選疫苗進(jìn)行效力檢測(cè)。通過(guò)Western blot、PCR方法、間接免疫熒光以及透射電鏡觀察等方法,驗(yàn)證歐洲型PRRS重組腺病毒rAd-E35-IL-18構(gòu)建正確。通過(guò)生物反應(yīng)器培養(yǎng)HEK293細(xì)胞并擴(kuò)增歐洲型PRRS重組腺病毒rAd-E35-IL-18,確定最佳培養(yǎng)參數(shù),HEK293細(xì)胞在36-60h之間增長(zhǎng)速率較快,在36h時(shí)更換DMEM培養(yǎng)液,使細(xì)胞以較快速率生長(zhǎng),84h后細(xì)胞幾乎長(zhǎng)滿(mǎn)微載體表面,之后細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)呈下降趨勢(shì)。將12h、24h、36h、48h、60h、72h取樣的病毒液進(jìn)行病毒滴度測(cè)定,結(jié)果顯示,60h時(shí)病毒滴度較高。應(yīng)用重組腺病毒候選疫苗rAd-ORF3-ORF5-IL-18對(duì)小鼠和豬進(jìn)行免疫原性試驗(yàn)、攻毒試驗(yàn)和病毒載量檢測(cè),初步驗(yàn)證小鼠可以作為豬的替代模型。在小鼠替代模型基礎(chǔ)之上,對(duì)小鼠和豬進(jìn)行重組腺病毒梯度接種,檢測(cè)免疫組動(dòng)物的細(xì)胞因子和中和抗體水平。對(duì)免疫組進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn),進(jìn)一步驗(yàn)證小鼠可作為重組腺病候選疫苗的動(dòng)物替代模型。獲取特異性抗體,測(cè)定出各梯度相應(yīng)疫苗免疫應(yīng)答效價(jià),小鼠抗PRRSV抗體水平大于1:682.7時(shí),可初步作為樣品疫苗檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。
[Abstract]:Swine reproductive and respiratory syndrome (Procine reproductive and respirator syndrome) was first reported in China in the 1990s, and the pathogen was identified as American PRRSV.The disease is still one of the most important diseases affecting the pig industry in China. Since the outbreak, American type high pathogenic PRRSV and its mutant strains have been the main ones in China. In recent years, PRRS has broken the limitation of region. In Beijing, Hong Kong, Inner Mongolia and other places, European PRRSVS have been isolated one after another, which has increased the difficulty of prevention and treatment of PRRS in China. So far, there is no specific European PRRS vaccine in China. In this study, the recombinant PRRS adenovirus vaccine constructed in our laboratory was identified, and the candidate vaccine of PRRS recombinant adenovirus was amplified by bioreactor microcarrier culture system. The potency of recombinant adenovirus candidate vaccine was tested by animal substitution model test and serological substitution test. The construction of European type PRRS recombinant adenovirus rAd-E35-IL-18 was verified by Western blottir polymerase chain reaction, indirect immunofluorescence and transmission electron microscopy. HEK293 cells were cultured in bioreactor and the recombinant adenovirus rAd-E35-IL-18 of European type PRRS was amplified. The best culture parameter was determined that the growth rate of HEK293 cells was faster in the range of 36 to 60 h, and the culture medium of DMEM was replaced at 36 h. After the cells grew at a faster rate for 84 h, the surface of the microcarriers was almost covered, and then the growth state of the cells decreased. The virus titer was measured in the virus solution sampled for 72 hours after 12h ~ 24h ~ 36h ~ 48h ~ 48h ~ (60 h). The results showed that the titer of the virus was higher at 60h. The recombinant adenovirus candidate vaccine rAd-ORF3-ORF5-IL-18 was used for immunogenicity test, attack test and viral load detection in mice and pigs. It was preliminarily verified that mice could be used as a substitute model for pigs. On the basis of mouse substitute model, recombinant adenovirus gradients were inoculated to mice and pigs to detect cytokines and neutralizing antibodies in immunized animals. The immunized group was tested for the protection of virus attack to further verify that the mice could be used as an alternative animal model for recombinant adenosis vaccine. The specific antibody was obtained and the titer of immune response of each gradient vaccine was determined. When the level of anti PRRSV antibody in mice was greater than 1: 682.7, it could be used as the test standard of the sample vaccine.
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S852.4

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本文編號(hào)：2184353