【摘要】：羅非魚(yú)作為我國(guó)南方一種重要的養(yǎng)殖魚(yú)類,擁有生長(zhǎng)繁殖快、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。然而,近幾年爆發(fā)的無(wú)乳鏈球菌病威脅著羅非魚(yú)養(yǎng)殖業(yè),很大程度上影響著羅非魚(yú)產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。免疫防控被證實(shí)是羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌病防治的有效手段,因而相關(guān)疫苗的研制越來(lái)越受到人們的重視。無(wú)乳鏈球菌的表面成分在病原粘附宿主過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,且其免疫原性通常較好。因此,可用于研制疫苗的候選抗原。本論文選擇羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌的膽堿結(jié)合蛋白(Choline-binding protein,CBP)和莢膜多糖(Capsular polysaccharide,CPS)為抗原,研究其作為疫苗對(duì)羅非魚(yú)抗無(wú)乳鏈球菌感染的免疫保護(hù)效果。主要研究?jī)?nèi)容如下:1.無(wú)乳鏈球菌CBP基因的克隆、序列分析和原核表達(dá)對(duì)CBP基因進(jìn)行分子克隆,獲得了大小為1515 bp的核苷酸序列,編碼504個(gè)氨基酸。CBP蛋白在無(wú)乳鏈球菌中有高度的保守性,高達(dá)98%-100%。CBP含有兩種結(jié)構(gòu)域,分別是GBS Bsp-like repeat domain和Src Homology 3(SH3)domains。CBP蛋白沒(méi)有信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)域,是細(xì)胞的表面蛋白。構(gòu)建了pET28a-CBP質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3),獲得CBP表達(dá)菌株。在IPTG的作用下,成功誘導(dǎo)了目的蛋白的表達(dá)。使用鎳柱純化目的蛋白,得到了純度較高的目的蛋白。2.無(wú)乳鏈球菌CPS的提取、檢測(cè)和鑒定使用CTAB有機(jī)溶劑沉淀法提取羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌的CPS,使用蒽酮法檢測(cè)濃度,并對(duì)單糖組成和分子量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,本實(shí)驗(yàn)提取的CPS是由半乳糖、葡萄糖構(gòu)成的雜多糖;提取的CPS是相對(duì)均一組分,其分子量分布于40000 D-600000 D之間;本實(shí)驗(yàn)提取的CPS中未檢出蛋白質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)成功提取到了濃度、純度均較高的CPS。3.無(wú)乳鏈球菌免疫保護(hù)效果研究制備出CBP亞單位疫苗和莢膜多糖疫苗,腹腔注射免疫羅非魚(yú),免疫兩次即初次免疫和加強(qiáng)免疫,并實(shí)施攻毒試驗(yàn)。結(jié)果顯示,CBP組、CPS-TT組、CPS-CBP組、CPS組的相對(duì)保護(hù)率分別是:56.58%、69.03%、57.21%、42.79%。ELISA結(jié)果顯示,免疫后魚(yú)血清中的抗體水平出現(xiàn)不同程度的升高,CBP疫苗誘導(dǎo)的抗體滴度顯著高于CPS疫苗,表明疫苗可以誘導(dǎo)特異性抗體的出現(xiàn)。免疫保護(hù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示,CBP亞單位疫苗和莢膜多糖疫苗都能對(duì)羅非魚(yú)抗無(wú)乳鏈球菌的感染起到免疫保護(hù)效果,提高了羅非魚(yú)的抗菌能力。
[Abstract]:As an important breed of fish in the south of China, tilapia has the advantages of fast growth and reproduction and strong adaptability to the environment. However, the outbreak of Streptococcus lactis disease in recent years threatens the breeding of tilapia and affects the healthy development of the tilapia industry to a great extent. As a result, more and more attention has been paid to the development of the related vaccines. The surface composition of Streptococcus lactis plays an important role in the pathogenesis of the pathogen adhesion to host, and its immunogenicity is usually better. Therefore, it can be used to develop the candidate antigen of the vaccine. This paper selects the cholinergic binding protein (Choline-bindi) of Streptococcus niloticus. Ng protein, CBP) and capsule polysaccharide (Capsular polysaccharide, CPS) were used as antigens to study the immune protection effect of vaccine against Streptococcus nactis free streptococcus infection. The main contents are as follows: 1. cloning of CBP gene of Streptococcus nactis, sequence analysis and prokaryotic expression of molecular cloning of CBP gene, and obtained a nucleus of 1515 BP size. The 504 amino acid.CBP protein encoded by the glycoside sequence is highly conserved in Streptococcus free Streptococcus, and up to 98%-100%.CBP contains two domains, which are GBS Bsp-like repeat domain and Src Homology 3 (SH3) domains.CBP protein without signal peptide and transmembrane domain. It is the surface protein of the cell. Enterobacteriaceae BL21 (DE3) obtained the CBP expression strain. Under the action of IPTG, the expression of the target protein was successfully induced. The purify protein was purified by the nickel column and the purity of the target protein,.2. Lactococcus lactis CPS, was extracted, and the CTAB organic solvent precipitation method was used to extract CPS of Streptococcus nilacae from the source of tilapia, and the anthrone method was used. The concentration was detected and the monosaccharide composition and molecular weight were detected. The results showed that the CPS extracted by this experiment was a heteropolysaccharide composed of galactose and glucose; the extracted CPS was a relatively homogeneous component, its molecular weight was between 40000 D-600000 D, and the protein extracted from the experiment was not detected. The concentration and purity of the experiment were successfully extracted. High CPS.3. Streptococcus free Streptococcus immune protection effect study to prepare CBP subunit vaccine and capsule polysaccharide vaccine, intraperitoneal injection of immunized tilapia, immunization two times, primary immunization and enhanced immunization, and carrying out the attack test. The results showed that the relative protection rate of group CBP, CPS-TT group, CPS-CBP group and CPS group were respectively: 56.58%, 69.03%, 57.21%, 42.79%., respectively. The ELISA results showed that the antibody level in the fish serum was elevated in varying degrees after immunization. The antibody titer induced by the CBP vaccine was significantly higher than that of the CPS vaccine, indicating that the vaccine could induce the emergence of specific antibodies. The protective test results showed that the CBP subunit vaccine and the capsular polysaccharide vaccine were all susceptible to the anti Streptococcus mutans of tilapia. The effect of immune protection was enhanced, and the antibacterial ability of tilapia was improved.
【學(xué)位授予單位】：中山大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S943

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