本文關(guān)鍵詞：用于發(fā)酵黃芪的益生菌株FGM誘變選育及突變株特性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院》 2015年

用于發(fā)酵黃芪的益生菌株FGM誘變選育及突變株特性研究

陳婕  

【摘要】：黃芪多糖具有多種重要的藥理作用,非解乳糖鏈球菌FGM是分離自雞盲腸,能夠發(fā)酵黃芪,提高多糖提取率的益生菌。為了進(jìn)一步提升菌株FGM的發(fā)酵性能,揭示黃芪經(jīng)發(fā)酵后多糖含量提高的潛在機(jī)制,本研究采用紫外線(UV)和亞硝基胍(NTG)對(duì)FGM進(jìn)行誘變選育,用誘變菌株發(fā)酵黃芪,通過水提醇沉法提取發(fā)酵產(chǎn)物中的多糖,苯酚硫酸法測(cè)定多糖含量,篩選得到了兩株高多糖得率菌株,分別從穩(wěn)定性、安全性、生化特征、發(fā)酵酶的相關(guān)基因克隆和表達(dá)等方面進(jìn)行評(píng)價(jià)和研究,并對(duì)菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序與比較基因組學(xué)分析。具體研究結(jié)果如下:(1)采用UV、NTG和UV-NTG復(fù)合誘變的方法,對(duì)FGM株進(jìn)行誘變選育。結(jié)果顯示,UV照射10~120 s所得的菌株發(fā)酵黃芪后產(chǎn)物中多糖含量均呈升高趨勢(shì),NTG處理所得菌株發(fā)酵黃芪后產(chǎn)物中多糖含量變化無規(guī)律性。UV誘變的最佳條件是在紫外燈下處理90 s,最終發(fā)酵產(chǎn)物中多糖含量為235.51 mg/g,較出發(fā)菌株提高了58.13%,將該菌株命名為U90;UV-NTG復(fù)合誘變的最佳條件是先用紫外燈照射10 s,再用1.0 g/L的NTG處理10 min,最終其發(fā)酵產(chǎn)物中多糖含量可達(dá)293.39 mg/g,較出發(fā)菌株提高了94.99%,將該菌株命名為UN10-1。(2)將U90和UN10-1連續(xù)傳代10次,每代均分析發(fā)酵黃芪后多糖的提取率,評(píng)價(jià)遺傳穩(wěn)定性。U90連續(xù)傳6代,取每代菌株發(fā)酵黃芪后產(chǎn)物中多糖含量穩(wěn)定在233.6±1.66 mg/g,第4代多糖含量最高,為235.85±0.78 mg/g,從7代開始多糖含量隨傳代次數(shù)增加而減少。菌株UN10-1產(chǎn)糖量比較穩(wěn)定,含量為292.06±0.89 mg/g。生化鑒定結(jié)果提示,UN10-1連續(xù)傳代10次產(chǎn)糖量仍趨于穩(wěn)定的原因可能與其能利用核糖、乳糖、阿拉伯糖有關(guān)。(3)分別用UN10-1菌懸液和48 h黃芪發(fā)酵液灌胃小鼠,0.5 m L/次,1次/d,連續(xù)灌胃3 d,觀察7 d,灌服等量生理鹽水作對(duì)照。觀察記錄小鼠日常行為及體重,測(cè)定血液生理指標(biāo),觀察主要臟器(心、肝、脾、肺、腎、胸腺、小腸)及組織形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果顯示,UN10-1對(duì)小鼠生長發(fā)育及組織形態(tài)學(xué)無不良影響,提示該菌株安全無毒。(4)分析了UN10-1發(fā)酵產(chǎn)糖相關(guān)基因gal E、dex B、aga2、ldh、rec A。成功擴(kuò)增出rec A和aga2基因,以rec A為內(nèi)參基因分析了aga2基因在黃芪發(fā)酵過程中的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),aga2基因在發(fā)酵24 h內(nèi)表達(dá)呈上升趨勢(shì),24 h時(shí)該基因表達(dá)量是初始發(fā)酵的9.54倍;24 h~60 h該基因表達(dá)呈下降趨勢(shì),60 h~72 h又略有升高。(5)比較基因組學(xué)分析結(jié)果顯示,在KEGG數(shù)據(jù)庫中注釋得到FGM和UN10-1位于糖代謝通路上的基因分別有125個(gè)和124個(gè),SNP檢測(cè)發(fā)現(xiàn)UN10-1有1個(gè)無義突變位點(diǎn)和26個(gè)位于基因區(qū)的非同義突變位點(diǎn)。綜上所述,采用UV和NTG復(fù)合誘變益生菌FGM可獲得發(fā)酵黃芪提取多糖性能更優(yōu)的菌株UN10-1,該菌株對(duì)小鼠無毒副作用;誘變菌株UN10-1與出發(fā)菌株FGM相比,發(fā)酵過程中糖代謝酶相關(guān)基因aga2在發(fā)酵過程中的表達(dá)量有升高趨勢(shì);比較基因組學(xué)分析結(jié)果表明UN10-1有基因突變。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.6
【目錄】：

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