本文關(guān)鍵詞：文昌魚(yú)抗菌肽基因的鑒定和功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《中國(guó)海洋大學(xué)》 2015年

文昌魚(yú)抗菌肽基因的鑒定和功能研究

劉浩涵  

【摘要】：文昌魚(yú)是一種重要的模式生物,被認(rèn)為是從無(wú)脊椎動(dòng)物到脊椎動(dòng)物間的過(guò)渡物種,有著重要的進(jìn)化地位�？咕氖菢�(gòu)成生物體先天性免疫的重要組成成分,能快速高效殺死入侵病原體,也是目前應(yīng)對(duì)由于抗生素濫用所引起的細(xì)菌抗藥性問(wèn)題的重要替代途徑之一。本文以青島文昌魚(yú)為研究對(duì)象,成功從其cDNA文庫(kù)中鑒定出一種新型抗菌肽基因,并對(duì)組織分布,以及編碼的成熟肽的功能及其抑菌機(jī)制進(jìn)行研究。本文依據(jù)進(jìn)化關(guān)系較近物種間抗菌肽基因所編碼的前體肽的信號(hào)肽序列高保守性這一特點(diǎn),以盲鰻(Myxine glutinosa)抗菌肽HFIAP-1的信號(hào)肽為檢索條件,通過(guò)生物信息學(xué)分析,在佛羅里達(dá)文昌魚(yú)數(shù)據(jù)庫(kù)中確定了一條預(yù)測(cè)的抗菌肽基因序列,并從青島文昌魚(yú)cDNA文庫(kù)中成功克隆出目標(biāo)抗菌肽基因Bjampl的完整ORF,化學(xué)合成其編碼的成熟抗菌肽多肽段mBjAMP1,研究了mBjAMP1的抑菌功能,并對(duì)其抑菌機(jī)制和溶血性、細(xì)胞毒性進(jìn)行了探索。通過(guò)生物信息學(xué)分析,我們確定了青島文昌魚(yú)的一條抗菌肽目標(biāo)序列Bjampl,采用PCR及RACE技術(shù)成功克隆出該基因完整ORF。組織分布表明,Bjampl主要在腸、鰓、肝盲囊、肌肉、脊索中大量表達(dá),而在精巢和卵巢中表達(dá)較少。經(jīng)LPS/LTA處理后,其表達(dá)量在脊索、肌肉、肝盲囊中的表達(dá)量顯著升高,表明Bjampl可能參與到了文昌魚(yú)的免疫反應(yīng)之中。Bjampl的完整ORF長(zhǎng)294 bp,編碼一條包含97個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈；經(jīng)分析,該多肽鏈氨基端的前24個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成信號(hào)肽,中間為一段陰離子富集區(qū),羧基端為一陽(yáng)離子富集區(qū)。經(jīng)預(yù)測(cè),成熟抗菌肽為位于R75R76雙堿性氨基酸殘基剪切位點(diǎn)之后的由21個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的多肽段,并命名為mBjAMP1,其分子質(zhì)量為2.5 KDa,等電點(diǎn)為11.6,疏水性氨基酸殘基比例為38%,靜電荷為+6,含有兩段α螺旋結(jié)構(gòu)。采用化學(xué)合成法合成了該21氨基酸殘基構(gòu)成的多肽段mBjAMP1,并對(duì)其羧基端進(jìn)行了酰胺化處理。通過(guò)圓二色性光譜(CD)實(shí)驗(yàn)證明,在PBS溶液中,mBjAMP1以一種無(wú)規(guī)卷曲的構(gòu)象存在,而處于SDS,三氟乙醇(TFE)這些細(xì)菌細(xì)胞膜模擬環(huán)境中時(shí),則呈現(xiàn)出a螺旋構(gòu)象,這表明,nBjAMP1在與細(xì)胞膜接近時(shí),可能經(jīng)歷了一個(gè)由無(wú)規(guī)卷曲向a螺旋的構(gòu)象轉(zhuǎn)變過(guò)程。抑菌實(shí)驗(yàn)表明,mBjAMP1對(duì)革蘭氏陰性菌及革蘭氏陽(yáng)性菌均具有抑菌效果,實(shí)驗(yàn)中各種細(xì)菌的最低抑菌濃度(MIC)分別為：金黃色葡萄球菌(S. aureus) 6.3μg/ml、藤黃微球菌(M. Luteus) 6.3μg/ml,大腸桿菌(E. coli) 6.3μg/ml、鰻弧菌(V. anguillarum) 12.5μg/ml。細(xì)胞膜的去極化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,mBjAMP1可引起大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜的去極化作用,且引起去極化的速度和程度呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性。這表明mBjAMP1在發(fā)揮抑菌功能時(shí),會(huì)作用于細(xì)菌的細(xì)胞膜上,引起細(xì)菌細(xì)胞膜上電位的改變,從而導(dǎo)致去極化作用的發(fā)生。細(xì)胞膜通透性改變實(shí)驗(yàn)中,被mBjAMP1處理后的細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性相對(duì)于未處理組有顯著增加,且呈現(xiàn)出濃度依賴(lài)性。這表明,mBjAMP1作用于細(xì)菌時(shí),破壞了其細(xì)胞膜的完整性,使其通透性增加,進(jìn)而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌的死亡。酶聯(lián)吸附試驗(yàn)(ELISA)證明mBjAMP1能夠與病原分子模式LPS、LTA特異性結(jié)合,其可能是一種病原分子模式識(shí)別受體。在透射電鏡實(shí)驗(yàn)中我們觀察到,細(xì)菌的細(xì)胞壁遭到了嚴(yán)重破壞,細(xì)胞質(zhì)變得透明化,同時(shí),細(xì)菌細(xì)胞膜表面不再平滑,在處理組的金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜表面出現(xiàn)多處明顯凹陷的小洞。這表明mBjAMP1與細(xì)菌作用時(shí),破壞了細(xì)菌的細(xì)胞壁,并可能在細(xì)胞膜上形成孔洞。溶血實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)(MTT比色法)表明,mBjAMP1不具有溶血性和細(xì)胞毒性。綜上,我們判定,Bjamp1是青島文昌魚(yú)的一個(gè)抗菌肽基因,由其編碼的成熟肽nBjAMP1是一個(gè)對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌及革蘭氏陰性菌均有抑菌效果,通過(guò)破壞細(xì)胞膜完整性的方式發(fā)揮抑菌活力,且無(wú)溶血性和細(xì)胞毒性的陽(yáng)離子抗菌肽。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S917.4
【目錄】：

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