本文選題：鵝細小病毒 + SH3BP4蛋白��； 參考：《吉林農(nóng)業(yè)大學》2017年碩士論文

【摘要】：鵝細小病毒屬于細小病毒科依賴病毒屬的成員。該病毒所引起的鵝傳染病稱為小鵝瘟。主要感染3-20日齡的雛鵝或雛番鴨,該病主要病理變化為全身敗血性病變、纖維素性及滲出性腸炎,最后形成腸內(nèi)栓塞。該病傳播速度快,且具有高度傳染性,病死率可高達95%以上,給我國水禽養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重危害,造成了巨大的經(jīng)濟損失。該病主要通過帶毒種鵝垂直傳播給小鵝,因此,防止病毒的垂直傳播是關鍵,研究鵝細小病毒治病機理,掌握病毒蛋白與宿主細胞蛋白之間的相互作用,對GPV的有效防控具有重要意義。本實驗室在前期工作中,利用酵母雙雜交技術篩選出3個與GPV-VP1蛋白相互作用的陽性克隆,其中的一個基因為479 bp,經(jīng)過BLAST在線比對,與SH3BP4蛋白同源性為99%,為了進一步驗證SH3BP4蛋白與VP1的相互作用,研究其對GPV增殖的影響,進行了本實驗。PCR擴增完整的SH3BP4基因序列,構建原核表達載體pET-28aSH3BP4,IPTG誘導表達,純化蛋白,產(chǎn)物進行SDS-PAGE分析,蛋白大小約為106kDa,同時,誘導表達實驗室的pGEX-4T-1-VP1質(zhì)粒,應用GST-pull down技術,在體外驗證了SH3BP4蛋白與VP1蛋白可以相互作用。構建真核表達質(zhì)粒pcDNA-3.0-SH3BP4,轉染DEF,同時GPV感染DEF,以此為實驗組,設置3組對照,分別為pcDNA-3.0+GPV,lip+GPV,DEPC+GPV,在作用12 h和24 h后,用熒光定量PCR檢測病毒核酸的拷貝數(shù),分析結果得知,在細胞內(nèi),轉染12 h,各組之間GPV核酸拷貝數(shù)差異不明顯,轉染24 h,對照組的拷貝數(shù)是實驗組的4倍,由此表明,SH3BP4在細胞內(nèi)抑制了GPV的增殖;將純化的SH3BP4蛋白以不同體積與GPV在細胞外感作,同時設置GPV與牛血清白蛋白為對照組,感染DEF,24 h后,熒光定量PCR檢測GPV的核酸拷貝數(shù),分析結果得知,隨著蛋白量增加,GPV拷貝數(shù)逐漸降低。由此說明,在細胞外,SH3BP4蛋白抑制了GPV的增殖。
[Abstract]:Goose parvovirus is a member of the dependent genus of the parvoviridae. The goose infection caused by the virus is called goose plague. The main pathological changes were systemic sepsis, cellulose enteritis and exudative enteritis. The disease spreads rapidly and is highly infectious, and the mortality rate can be as high as 95%, which brings serious harm to the waterfowl breeding industry in China and causes huge economic losses. The disease is mainly transmitted to goslings vertically by the goose carrying virus. Therefore, preventing the vertical transmission of the virus is the key to study the therapeutic mechanism of goose parvovirus and to understand the interaction between virus protein and host cell protein. It is of great significance for the effective prevention and control of GPV. In our previous work, three positive clones interacting with GPV-VP1 protein were screened by yeast two-hybrid technique. The homology between SH3BP4 protein and SH3BP4 protein was 99. In order to further verify the interaction between SH3BP4 protein and VP1 protein and study the effect of SH3BP4 protein on GPV proliferation, we amplified the complete SH3BP4 gene sequence by PCR, constructed the prokaryotic expression vector pET-28aSH3BP4IPTG, and purified the protein. SDS-PAGE analysis showed that the protein size was about 106kDa. meanwhile, the plasmid pGEX-4T-1-VP1 was induced and expressed in the laboratory. The interaction between SH3BP4 protein and VP1 protein was confirmed by GST-pull down technique in vitro. Eukaryotic expression plasmid pcDNA-3.0-SH3BP4 was constructed and transfected with DEF. and GPV was infected with DEF. as experimental group, three groups of control groups were set up: pcDNA-3.0 GPVlip GPV-DEPC GPVP GPV.After 12 h and 24 h exposure, the copy number of viral nucleic acid was detected by fluorescence quantitative PCR. At 12 h after transfection, there was no significant difference in the number of GPV nucleic acid copies among the three groups. After 24 h transfection, the copy number of the control group was 4 times that of the experimental group, which indicated that SH3BP4 inhibited the proliferation of GPV in the cells. The purified SH3BP4 protein was treated with different volumes and GPV in vitro, and GPV and bovine serum albumin (BSA) were used as control group. After infected with DEF4 for 24 h, the nucleic acid copy number of GPV was detected by fluorescence quantitative PCR. The copy number of GPV decreased with the increase of protein content. Therefore, SH3 BP4 protein inhibited the proliferation of GPV.
【學位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S852.65

【參考文獻】

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本文編號：2064655