本文選題：鵝細(xì)小病毒 + SH3BP4蛋白�。� 參考：《吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：鵝細(xì)小病毒屬于細(xì)小病毒科依賴病毒屬的成員。該病毒所引起的鵝傳染病稱為小鵝瘟。主要感染3-20日齡的雛鵝或雛番鴨,該病主要病理變化為全身敗血性病變、纖維素性及滲出性腸炎,最后形成腸內(nèi)栓塞。該病傳播速度快,且具有高度傳染性,病死率可高達(dá)95%以上,給我國(guó)水禽養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重危害,造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病主要通過(guò)帶毒種鵝垂直傳播給小鵝,因此,防止病毒的垂直傳播是關(guān)鍵,研究鵝細(xì)小病毒治病機(jī)理,掌握病毒蛋白與宿主細(xì)胞蛋白之間的相互作用,對(duì)GPV的有效防控具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中,利用酵母雙雜交技術(shù)篩選出3個(gè)與GPV-VP1蛋白相互作用的陽(yáng)性克隆,其中的一個(gè)基因?yàn)?79 bp,經(jīng)過(guò)BLAST在線比對(duì),與SH3BP4蛋白同源性為99%,為了進(jìn)一步驗(yàn)證SH3BP4蛋白與VP1的相互作用,研究其對(duì)GPV增殖的影響,進(jìn)行了本實(shí)驗(yàn)。PCR擴(kuò)增完整的SH3BP4基因序列,構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-28aSH3BP4,IPTG誘導(dǎo)表達(dá),純化蛋白,產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析,蛋白大小約為106kDa,同時(shí),誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)室的pGEX-4T-1-VP1質(zhì)粒,應(yīng)用GST-pull down技術(shù),在體外驗(yàn)證了SH3BP4蛋白與VP1蛋白可以相互作用。構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-3.0-SH3BP4,轉(zhuǎn)染DEF,同時(shí)GPV感染DEF,以此為實(shí)驗(yàn)組,設(shè)置3組對(duì)照,分別為pcDNA-3.0+GPV,lip+GPV,DEPC+GPV,在作用12 h和24 h后,用熒光定量PCR檢測(cè)病毒核酸的拷貝數(shù),分析結(jié)果得知,在細(xì)胞內(nèi),轉(zhuǎn)染12 h,各組之間GPV核酸拷貝數(shù)差異不明顯,轉(zhuǎn)染24 h,對(duì)照組的拷貝數(shù)是實(shí)驗(yàn)組的4倍,由此表明,SH3BP4在細(xì)胞內(nèi)抑制了GPV的增殖;將純化的SH3BP4蛋白以不同體積與GPV在細(xì)胞外感作,同時(shí)設(shè)置GPV與牛血清白蛋白為對(duì)照組,感染DEF,24 h后,熒光定量PCR檢測(cè)GPV的核酸拷貝數(shù),分析結(jié)果得知,隨著蛋白量增加,GPV拷貝數(shù)逐漸降低。由此說(shuō)明,在細(xì)胞外,SH3BP4蛋白抑制了GPV的增殖。
[Abstract]:Goose parvovirus is a member of the dependent genus of the parvoviridae. The goose infection caused by the virus is called goose plague. The main pathological changes were systemic sepsis, cellulose enteritis and exudative enteritis. The disease spreads rapidly and is highly infectious, and the mortality rate can be as high as 95%, which brings serious harm to the waterfowl breeding industry in China and causes huge economic losses. The disease is mainly transmitted to goslings vertically by the goose carrying virus. Therefore, preventing the vertical transmission of the virus is the key to study the therapeutic mechanism of goose parvovirus and to understand the interaction between virus protein and host cell protein. It is of great significance for the effective prevention and control of GPV. In our previous work, three positive clones interacting with GPV-VP1 protein were screened by yeast two-hybrid technique. The homology between SH3BP4 protein and SH3BP4 protein was 99. In order to further verify the interaction between SH3BP4 protein and VP1 protein and study the effect of SH3BP4 protein on GPV proliferation, we amplified the complete SH3BP4 gene sequence by PCR, constructed the prokaryotic expression vector pET-28aSH3BP4IPTG, and purified the protein. SDS-PAGE analysis showed that the protein size was about 106kDa. meanwhile, the plasmid pGEX-4T-1-VP1 was induced and expressed in the laboratory. The interaction between SH3BP4 protein and VP1 protein was confirmed by GST-pull down technique in vitro. Eukaryotic expression plasmid pcDNA-3.0-SH3BP4 was constructed and transfected with DEF. and GPV was infected with DEF. as experimental group, three groups of control groups were set up: pcDNA-3.0 GPVlip GPV-DEPC GPVP GPV.After 12 h and 24 h exposure, the copy number of viral nucleic acid was detected by fluorescence quantitative PCR. At 12 h after transfection, there was no significant difference in the number of GPV nucleic acid copies among the three groups. After 24 h transfection, the copy number of the control group was 4 times that of the experimental group, which indicated that SH3BP4 inhibited the proliferation of GPV in the cells. The purified SH3BP4 protein was treated with different volumes and GPV in vitro, and GPV and bovine serum albumin (BSA) were used as control group. After infected with DEF4 for 24 h, the nucleic acid copy number of GPV was detected by fluorescence quantitative PCR. The copy number of GPV decreased with the increase of protein content. Therefore, SH3 BP4 protein inhibited the proliferation of GPV.
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2064655