本文選題：桑樹 + 乙烯��； 參考：《西南大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：桑樹是一種多年生的木本經(jīng)濟(jì)作物,不僅作為家蠶的飼料被大面積種植,其果實(shí)桑椹,風(fēng)味獨(dú)特,營養(yǎng)豐富,深受人們歡迎。桑樹還能適應(yīng)很多逆境脅迫,如寒冷、水淹、干旱以及鹽堿環(huán)境。隨著蠶桑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,桑樹的商業(yè)應(yīng)用前景越來越廣闊。乙烯是一種結(jié)構(gòu)簡單的植物氣體激素,在植物整個(gè)生命周期中調(diào)控多種生長發(fā)育和脅迫應(yīng)激反應(yīng),ACO是乙烯生物合成途徑中的關(guān)鍵酶,能催化ACC形成乙烯。啟動(dòng)子在基因表達(dá)調(diào)控方面起著至關(guān)重要的作用,探索啟動(dòng)子功能與基因表達(dá)之間的關(guān)系有助于通過基因工程手段調(diào)控基因表達(dá)。目前有關(guān)桑樹ACO基因的研究主要集中在其轉(zhuǎn)錄表達(dá)層面,對(duì)其啟動(dòng)子的功能還未知。本研究對(duì)川桑MnACO啟動(dòng)子序列進(jìn)行克隆以及生物信息學(xué)分析,構(gòu)建植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化擬南芥,對(duì)陽性轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行非生物脅迫處理及GUS組織化學(xué)分析,探究ACO基因及其啟動(dòng)子在桑樹生長發(fā)育和逆境中的作用,為改良桑樹品種奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ);并探索乙烯利和1-MCP對(duì)桑椹中Ma ACO2基因表達(dá)的影響,為桑樹品種選育,改良桑椹品質(zhì)及調(diào)節(jié)后熟進(jìn)程提供理論依據(jù)。1.桑樹MnACO啟動(dòng)子擴(kuò)增與序列分析以川桑基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得的啟動(dòng)子序列分別為1518 bp和1429 bp。分析啟動(dòng)子序列,發(fā)現(xiàn)MnACO1和MnACO2啟動(dòng)子各含有1個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),分別在起始密碼子上游-101bp處和-106 bp處,且兩者都有含有TATA-box,表明其具有啟動(dòng)子的核心啟動(dòng)元件,能啟動(dòng)基因正常轉(zhuǎn)錄。兩者都含有響應(yīng)外界環(huán)境刺激的TC-rich repeats和響應(yīng)赤霉素的GARE-motif,含有響應(yīng)外界熱刺激的元件,MnACO1為MBS,而MnACO2為HSE。MnACO1含有響應(yīng)植物激素的Aux RE元件,MnACO2含有響應(yīng)水楊酸的TCA-element元件。結(jié)果表明MnACO1和MnACO2啟動(dòng)子具有啟動(dòng)子的一般特性和功能,能使植物在逆境環(huán)境中通過調(diào)節(jié)基因的表達(dá)抵御多種刺激。2.桑樹MnACO啟動(dòng)子調(diào)控轉(zhuǎn)基因擬南芥中GUS基因的表達(dá)將啟動(dòng)子片段與GUS報(bào)告基因連接,構(gòu)建植物表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)化擬南芥,分別獲得2株p MnACO1::GUS和4株p MnACO2::GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥。分析T3代轉(zhuǎn)基因植株不同生長階段的GUS活性,結(jié)果顯示,p MnACO1::GUS植株生長發(fā)育的各時(shí)期均能檢測(cè)到GUS活性,且較p MnACO2::GUS植株高;p MnACO2::GUS植株生長1周和2周時(shí),根尖中GUS活性較葉片高,但生長至4周,根尖和蓮座葉片沒有檢測(cè)到明顯GUS活性,僅蓮座葉叢的中心有少量GUS活性。p MnACO1::GUS植株的花瓣、花藥、花絲以及柱頭中有較高GUS活性,花柱和花序軸中的活性較低;p MnACO2::GUS植株的花瓣、花藥、花絲、柱頭和莖生葉中,能檢測(cè)到GUS活性,但花柱和花序軸中無GUS活性。p MnACO1::GUS果柄以及果莢中有少量GUS活性,但p MnACO2::GUS的果柄和果莢中無GUS活性。結(jié)果表明,MnACO啟動(dòng)子在擬南芥不同生長階段,其表達(dá)部位及表達(dá)活性不同,推測(cè)Ma ACO2具有組織特異性,與果實(shí)成熟密切相關(guān),可能為果實(shí)特異性啟動(dòng)子,可利用其對(duì)桑椹品質(zhì)進(jìn)行改良。3.不同處理對(duì)桑樹MnACO啟動(dòng)子及基因的影響MnACO1和MnACO2啟動(dòng)子對(duì)不同脅迫呈現(xiàn)不同的響應(yīng)模式,且桑幼苗Ma ACO基因經(jīng)處理后的表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS染液吸光值變化趨勢(shì)一致。Na Cl處理后,MnACO啟動(dòng)子GUS染液吸收值隨處理時(shí)間而增加。損傷處理上調(diào)p MnACO::GUS轉(zhuǎn)基因植株中GUS基因的表達(dá),12 h的GUS活性最高。p MnACO1::GUS植株經(jīng)ABA處理3 h后染色最深,隨后下降;p MnACO2::GUS植株經(jīng)ABA處理后,24 h的GUS活性最高。SA處理后,p MnACO1::GUS和p MnACO2::GUS植株的GUS活性在24 h最高。Na Cl、ABA、SA以及損傷葉片都能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因擬南芥中GUS基因的上調(diào)表達(dá),推測(cè)桑樹在遭受脅迫時(shí),Ma ACO啟動(dòng)子被激活,啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),從而激活乙烯生物合成途徑,促成乙烯生成,且桑樹在逆境脅迫時(shí),MnACO1啟動(dòng)子發(fā)揮更重要的作用,可將MnACO1基因作為改良桑樹品種抗逆性靶基因。4.乙烯利與1-MCP處理對(duì)桑椹中Ma ACO基因表達(dá)的影響桑樹盛花期后21天和26天,分別用乙烯利噴灑桑椹表面,采摘后桑椹經(jīng)1-MCP熏蒸處理,測(cè)定其花青素和總糖含量,分析Ma ACO2以及花青素相關(guān)基因Ma DFR和Ma ANS的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。桑椹經(jīng)過乙烯利處理后,花青素含量和總糖含量與對(duì)照相比都有明顯增加,與花青素合成有關(guān)的基因表達(dá)也受乙烯利上調(diào),經(jīng)1-MCP熏蒸的桑椹花青素含量和總糖含量與對(duì)照相比都有所下降。與對(duì)照相比,21DAF桑椹經(jīng)乙烯利處理后,Ma ACO2表達(dá)量先上調(diào)后下調(diào);26DAF桑椹經(jīng)乙烯利處理后,Ma ACO2表達(dá)量在處理后8 h受到顯著上調(diào),處理后32 h,表達(dá)量高于對(duì)照;采后桑椹經(jīng)1-MCP熏蒸,Ma ACO2基因的表達(dá)受到抑制。結(jié)果表明,Ma ACO2在桑椹成熟過程中的表達(dá)量受乙烯利和1-MCP調(diào)節(jié),桑椹花青素和總糖含量的積累也隨之改變,因此,Ma ACO2在桑椹成熟過程發(fā)揮重要作用。
[Abstract]:In this study , the promoter sequence of mulberry was cloned and transformed into Arabidopsis thaliana . The promoter sequence was cloned and transformed into Arabidopsis thaliana . The GUS activity was detected in the leaves of leaves , anther , flower and stigma . The results showed that the GUS activity was not detected in the leaves of leaves , anther , filaments , stigma and stem of the transgenic Arabidopsis thaliana . After treated with ethrel , the content of anthocyanin and total sugar of mulberry were increased significantly , and the content of anthocyanin and total sugar increased after treatment with 1 - MCP . The accumulation of mulberry anthocyanin and total sugar content also changes , so Ma ACO2 plays an important role in the mature process of mulberry .
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q943.2;S888

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2014915