本文選題：谷氨酰胺 + 瘤胃上皮細胞　； 參考：《河南科技大學》2017年碩士論文

【摘要】：谷氨酰胺(Glutamine,Gln)因其具有獨特而復雜的生理功能,已成為營養(yǎng)學、生理學、營養(yǎng)免疫學等學科領(lǐng)域的研究熱點,特別在維持腸道健康狀態(tài)或修復病理腸道結(jié)構(gòu)中具有重要作用。目前瘤胃pH過低造成瘤胃上皮細胞(Ruminal Epithelium Cell,REC)受到一定損傷的問題依然存在,Gln是否對酸損傷的REC有修復作用仍未可知。因此,本試驗以Gln對體外培養(yǎng)的損傷REC的影響為研究主題,初步探索Gln在瘤胃上皮生長及損傷修復中的作用機理。實驗一:REC原代分離和培養(yǎng)首先用9種不同種類和劑量的抗生素洗滌液沖洗瘤胃上皮組織;然后采用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA在不同條件下對瘤胃上皮進行連續(xù)消化和分步消化以及先用0.1%膠原酶I消化再用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA在37℃分步消化。結(jié)果表明:瘤胃上皮分別經(jīng)過6倍青鏈霉素和6倍慶大霉素洗滌液的清洗后能有效去除瘤胃上皮表面微生物,瘤胃上皮先經(jīng)過0.1%膠原酶I消化30min再經(jīng)0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA分步消化后可獲得較多的且活性較高的上皮細胞。實驗二:細胞純化與鑒定分別使用細胞刮除法,差速貼壁法,相差消化法三種不同方法進行細胞純化,繪制相應(yīng)的細胞生長曲線,使用HE染色方法和流式細胞技術(shù)分別從形態(tài)學和免疫學進行細胞鑒定。結(jié)果顯示:使用差速貼壁法純化后REC純度在95%以上,呈典型的鋪路石狀,生長曲線呈“S”型,活性較好,可用于后續(xù)試驗。實驗三:REC損傷模型的建立根據(jù)牛發(fā)生亞急性瘤胃酸中毒(Subacute Rumen Acidosis,SARA)時,瘤胃液pH及瘤胃液中各種揮發(fā)酸比例,設(shè)置四組試驗:第一組為對照組:pH 7.2正常培養(yǎng)基;第二組為用乳酸調(diào)整培養(yǎng)基pH 5.5組;第三組為用揮發(fā)酸100倍原液調(diào)整培養(yǎng)基pH 5.5組;第四組為用揮發(fā)酸+乳酸100倍原液調(diào)整培養(yǎng)基pH 5.5組。然后分別培養(yǎng)3、5、8、12、24 h,觀察每個時間點細胞生長及凋亡狀況。然后分別測定上清液中LDH、MDA、SOD、NO水平,以及細胞腫瘤壞死因子(TNF-α),炎癥因子(IL-1、IL-8),細胞間連接蛋白(Claudin-1、occludin),細胞表面受體(TLR-2、TLR-4)等基因mRNA水平變化。結(jié)果顯示:酸處理后12h時,細胞內(nèi)開始出現(xiàn)空泡,細胞間隙變大,隨后逐漸有細胞收縮,變形,漂起,呈明顯的凋亡現(xiàn)象。在3h時上清液中LDH水平顯著升高(P0.05),SOD水平顯著下降(P0.05),細胞TNF-α,L-1β、IL-8基因mRNA相對表達量顯著升高(P0.05),occludin的mRNA相對表達量顯著降低(P0.05),3h時細胞表面受體(TLR-2,TLR-4)基因mRNA相對表達量顯著升高(P0.05),而隨著酸處理時間的增加,細胞表面受體mRNA相對表達量水平逐漸下降。說明:酸處理3h時,細胞已受到了損傷。所以使用揮發(fā)酸和乳酸共同處理細胞3h時即能產(chǎn)生較明顯損傷效果,能成功建立損傷模型。實驗四:Gln對損傷模型的修復用揮發(fā)酸+乳酸100倍原液調(diào)整培養(yǎng)基使pH 5.5,培養(yǎng)3 h后,換含有不同濃度Gln的培養(yǎng)基(Gln濃度分別為4、8、12、32 m M/L)進行修復培養(yǎng)。培養(yǎng)12 h后,收集細胞上清液和細胞。同樣檢測上清液成分及細胞相應(yīng)腫瘤壞死因子、細胞表面受體、炎癥因子、細胞間連接蛋白等mRNA水平。結(jié)果顯示:低濃度的Gln細胞上清液中LDH水平較高;高濃度的Gln組其水平較低,TNF-α、IL-1β、IL-8、TLR-2、TLR-4基因mRNA水平較對照組均有所降低,occludin基因mRNA水平顯著升高(P0.05)。結(jié)論:Gln能通過促進細胞抗氧化酶的產(chǎn)生來增強細胞的抗氧化能力,促進上皮細胞間連接蛋白的表達,抑制炎性通路中促炎癥因子的表達,從而對損傷3h的REC具有一定的修復作用。
[Abstract]:The effects of glutamine ( Gln ) on rumen epithelial cells ( REC ) in rumen epithelial cells were studied . The results showed that the levels of mRNA relative to TNF - 偽 , IL - 1尾 , IL - 8 , TLR - 2 and TLR - 4 in the supernatant were significantly higher than those in the control group ( P0.05 ) .

【學位授予單位】：河南科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S823.5

【參考文獻】

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本文編號：1882318