發(fā)布時(shí)間：2018-04-28 18:16

  本文選題：黃河鯉魚(yú) + 抑制性消減雜交�。� 參考：《河南師范大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：生物在其生命周期中,基因按時(shí)間和空間的順序有序地進(jìn)行表達(dá),從而也決定了生命活動(dòng)的多樣性和復(fù)雜性。在魚(yú)類(lèi)性腺發(fā)育過(guò)程中,基因的時(shí)空表達(dá)方式也受到嚴(yán)格而精確的調(diào)控,不同的發(fā)育階段,其表達(dá)基因各不相同。通過(guò)比較卵巢不同發(fā)育時(shí)期的基因表達(dá)差異,即可能尋找到與卵巢發(fā)育密切相關(guān)的基因,因此,本文選取黃河鯉不同發(fā)育時(shí)期的卵巢進(jìn)行差異基因研究。本研究從mRNA水平上,分別以未分化性腺和二期卵巢為驗(yàn)證方(Tester),以成魚(yú)卵巢為驅(qū)動(dòng)方(Driver),構(gòu)建抑制性消減雜交文庫(kù);利用Sorthern斑點(diǎn)雜交篩選后測(cè)序得到文庫(kù)中的序列。借助GO信號(hào)通路分析其功能,從中選取與卵巢發(fā)育相關(guān)的候選基因,利用實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR驗(yàn)證其表達(dá)。進(jìn)而挑選Bmp基因進(jìn)行詳細(xì)研究,結(jié)合已有的黃河鯉轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)驗(yàn)證得到Bmp家族12個(gè)基因的cDNA序列,通過(guò)qRT-PCR分析其表達(dá)情況,挑選Bmp2、Bmp4和Bmp15進(jìn)行深入研究。借助鯉魚(yú)基因組信息對(duì)Bmp2、Bmp4和Bmp15所在染色體的基因結(jié)構(gòu)、染色體同線(xiàn)性分析,通過(guò)組織原位雜交和免疫組織化學(xué)染色方法對(duì)其進(jìn)行時(shí)空表達(dá)定位;利用Bmp信號(hào)通路抑制劑DSM體外處理性腺,初步探究Bmp信號(hào)通路對(duì)黃河鯉性別分化和早期卵巢發(fā)育的作用。研究主要成果如下:1.成功構(gòu)建黃河鯉魚(yú)未分化性腺和二期卵巢的抑制性消減雜交文庫(kù),經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化搖菌,兩個(gè)文庫(kù)一共得到約1200個(gè)單克隆,用巢式PCR進(jìn)行初步篩選,得到約600個(gè)含有插入片段的陽(yáng)性克隆;之后借助Sorthern斑點(diǎn)雜交,進(jìn)一步驗(yàn)證選出差異顯著的150個(gè)克隆送公司測(cè)序。2.測(cè)序得到的序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析,在Genebank中進(jìn)行Blast比對(duì),除去重復(fù)和一些微衛(wèi)星序列,兩個(gè)庫(kù)共得到78個(gè)unigene。GO分析文庫(kù)基因的生物信號(hào)通路,分類(lèi)分屬17類(lèi),其中較多基因ESTs序列分屬于蛋白質(zhì)水解作用,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分化和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)等。結(jié)合其基因功能分析和相關(guān)研究,選取與卵巢發(fā)育相關(guān)的22個(gè)候選基因(Bmp2,Pvalb,Mid1ip1l,Pax2,Zgc,Desmin,Bmp4等)進(jìn)行文庫(kù)驗(yàn)證,并對(duì)其功能進(jìn)行初步分析。3.選取可能參與卵巢發(fā)育的Bmp家族基因,在黃河鯉魚(yú)未分化性腺、幼魚(yú)和成魚(yú)雌雄性腺中對(duì)其表達(dá)模式定量分析,發(fā)現(xiàn)Bmp2、Bmp4和Bmp15分別在二期卵巢、未分化性腺和成熟卵巢中有高表達(dá),故挑選Bmp2、Bmp4和Bmp15進(jìn)行深入研究,驗(yàn)證得出Bmp2、Bmp4和Bmp15分別為2068、2037、2165的全長(zhǎng)序列,各編碼410、399和384個(gè)氨基酸,且羧基端均含有TGF-β結(jié)構(gòu)域。分析基因Bmp4基因在基因組骨架上有一個(gè)重復(fù)出現(xiàn),且其同線(xiàn)性分析染色體位置和其他物種差異較大。Bmp2和Bmp15分別位于黃河鯉第40號(hào)染色體和第5號(hào)染色體,同線(xiàn)性分析展示了和斑馬魚(yú)高度的進(jìn)化相似性。4.原位雜交和免疫組化定位發(fā)現(xiàn)Bmp2、Bmp4和Bmp15三個(gè)基因表達(dá)位置相似,在二期卵巢中均集中在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá),成熟卵巢時(shí)期集中表達(dá)在卵泡周?chē)钠べ|(zhì)小泡中,結(jié)合其表達(dá)量推測(cè)Bmp2是黃河鯉卵巢早期發(fā)育的重要調(diào)控基因;Bmp15基因則作為卵泡早期生長(zhǎng)調(diào)控基因可能參與黃河鯉卵巢中卵泡大小的發(fā)育。5.黃河鯉魚(yú)未分化性腺中Bmp信號(hào)通路受到DSM成功抑制后,三個(gè)雄性標(biāo)志基因(Amh,Dmrt1,Sox9a)在高濃度或者高劑量時(shí)出現(xiàn)顯著或極顯著表達(dá)上調(diào),雌性基因Cyp19和Foxl2表達(dá)量顯著降低,性腺在分子水平上出現(xiàn)偏向雄性分化的趨勢(shì),說(shuō)明Bmp信號(hào)通路對(duì)于未分化性腺向雌雄分化起重要調(diào)節(jié)作用;對(duì)二期卵巢處理后也顯示出抑制卵巢發(fā)育,故推測(cè)Bmp信號(hào)通路對(duì)于維持雌性卵巢早期正常發(fā)育有著重要的作用。綜上所述,通過(guò)構(gòu)建黃河鯉卵巢發(fā)育差異基因表達(dá)文庫(kù),從而找到與性別分化、發(fā)育等相關(guān)的基因,對(duì)于了解黃河鯉性腺發(fā)育的進(jìn)程,深入詳盡的知曉黃河鯉卵巢發(fā)育的分子機(jī)制有著非常重要的意義。同時(shí)為黃河鯉雌性發(fā)育控制機(jī)制的研究提供豐富的基因鑒定資源。
[Abstract]:In this paper , we studied the gene structure , chromosome and linear analysis of Bmp2 , BMP4 and Bmp15 in different developmental stages of the Yellow River carp . The results were as follows : 1 . The gene structure , chromosome and linear analysis of Bmp2 , BMP4 and Bmp15 were studied . The results showed that Bmp2 , BMP4 and Bmp15 were highly expressed in the ovary of the Yellow River . The results showed that Bmp2 , BMP4 and Bmp15 could be involved in the development of the ovarian follicles of the Yellow River .

【學(xué)位授予單位】：河南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前8條

1 侯斐;劉瑞霞;陰峧宏;;骨形態(tài)發(fā)生蛋白7/Smads信號(hào)通路及其在肝纖維化進(jìn)程中的作用[J];臨床肝膽病雜志;2016年05期

2 季豐琨;丑小冰;李文超;蔡剛;李浩宇;高亞兵;彭瑞云;;BMP-2和VEGF在兔髖臼缺損修復(fù)中表達(dá)研究[J];中國(guó)體視學(xué)與圖像分析;2016年01期

3 張運(yùn)峰;;免疫組化檢測(cè)BMP-6在乳腺癌臨床標(biāo)本中的表達(dá)差異[J];唐山師范學(xué)院學(xué)報(bào);2016年02期

4 王賽賽;王亞麗;沈丹;薛松磊;錢(qián)躍;史云強(qiáng);陳才;鐘繼漢;劉帥軍;高波;;BMPMP3、BMPBMP10、BMPBMP15基因在雛雞和成年雞主要器官中的表達(dá)特性研究[J];中國(guó)家禽;2016年04期

5 Qing Wang;Mei-Lan Xue;Gui-Qiu Zhao;Mei-Guang Liu;Yu-Na Ma;Yan Ma;;Form-deprivation myopia induces decreased expression of bone morphogenetic protein-2, 5 in guinea pig sclera[J];International Journal of Ophthalmology;2015年01期

6 王春慶;田秦杰;;卵巢發(fā)育研究進(jìn)展[J];生殖醫(yī)學(xué)雜志;2015年02期

7 符來(lái)想;程迅生;;負(fù)載BMP-2組織工程骨修復(fù)骨缺損的研究進(jìn)展[J];醫(yī)學(xué)綜述;2013年04期

8 葛燕;張家驊;;骨形態(tài)發(fā)生蛋白在動(dòng)物繁殖上的研究進(jìn)展[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2006年06期

，

本文編號(hào)：1816348