本文選題：金黃色葡萄球菌 + 皮寒藥　； 參考：《西南大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)作為一種食源性致病菌,不僅嚴(yán)重威脅著食品衛(wèi)生安全,而且在動(dòng)物生產(chǎn)上也具有嚴(yán)重的危害性。在醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)臨床上,金葡菌往往引起人類和動(dòng)物化膿性感染。隨著耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicilin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)臨床檢出率不斷升高,由其引起的感染現(xiàn)已成為全球性的衛(wèi)生難題。從天然藥物中尋找有效抗金黃色葡萄球菌的物質(zhì)是近年來抗菌藥物研發(fā)的一個(gè)方向。皮寒藥是川滇米口袋(Gueldenstaedtia delavayi Franch)的干燥全草,《西昌中草藥》記載其:“全草入藥,四季可采;性寒,味辛苦,清熱解毒、鎮(zhèn)痛”,是四川攀西地區(qū)特色藥用資源,在當(dāng)?shù)卦撍幹饕糜谙飧屑膊?具有藥食兩用的價(jià)值。迄今,對皮寒藥的研究報(bào)道較少,僅對其藥效學(xué)和活性成分進(jìn)行了部分研究。本課題通過提取分離皮寒藥不同部位藥物,以金黃色葡萄球菌為研究對象,篩選皮寒藥抑制金黃色葡萄球菌生長的有效部位,并研究皮寒藥有效部位抗菌作用機(jī)理。主要試驗(yàn)結(jié)果及結(jié)論如下:1.皮寒藥幾種不同部位對金黃色葡萄球菌抑菌活性研究利用有機(jī)溶劑石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分離提取皮寒藥不同部位,采用微量肉湯稀釋法測定皮寒藥不同部位對金葡菌質(zhì)控菌株ATCC25923和甲氧西林敏感金葡菌(Methicilin-susceptible Staphylococcu saureus,MSSA)臨床分離株RC-1、RC-3、RC-5及耐甲氧西林金葡菌臨床分離株DZ-1的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)。結(jié)果表明,皮寒藥正丁醇部位和水相部位對金葡菌生長無明顯影響。石油醚部位和乙酸乙酯部位均能不同程度抑制金葡菌質(zhì)控菌株和臨床分離株的生長,其MIC分別為15 mg·mL-1和7.5 mg·mL-1,MBC分別為30 mg·mL-1和15 mg·mL-1,結(jié)果顯示皮寒藥乙酸乙酯部位具有更好的抑菌活性。通過對皮寒藥乙酸乙酯部位幾種不同濃度藥物下金葡菌在不同時(shí)間點(diǎn)的菌落計(jì)數(shù),繪制金葡菌的生長曲線,試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1 MIC藥物組菌液濃度在2、4、6、10、24 h五個(gè)時(shí)間點(diǎn)極顯著低于菌液對照組和1/4 MIC藥物組(P0.01),在4、6、10、24 h四個(gè)時(shí)間點(diǎn),極顯著低于1/2 MIC藥物組。1/2倍MIC藥物組菌液濃度在2、4、6、10 h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)極顯著低于菌液對照組(P0.01),在2、4、6 h極顯著低于1/4 MIC組。1/4倍MIC藥物組菌液濃度在2、4、10 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)顯著低于菌液對照組(P0.01)。結(jié)果提示:皮寒藥石油醚部位和乙酸乙酯部位能抑制MSSA和MRSA的生長,與石油醚部位相比,乙酸乙酯部位顯示出更好的抑菌活性,且抑菌效果與藥物濃度呈正相關(guān)。2.皮寒藥乙酸乙酯部位對金黃色葡萄球菌抑菌機(jī)理研究通過測定金葡菌胞外堿性磷酸酶含量、培養(yǎng)液電導(dǎo)率、葡萄糖含量變化、糖代謝相關(guān)酶活及菌體可溶性蛋白含量變化,從皮寒藥乙酸乙酯部位對菌體細(xì)胞壁膜通透性、能量代謝、可溶性蛋白質(zhì)合成三個(gè)方面研究藥物對金葡菌的抑菌機(jī)理。結(jié)果顯示,MBC藥物濃度下,金葡菌培養(yǎng)液電導(dǎo)率不發(fā)生變化,胞外堿性磷酸酶活性在藥物處理后1 h和3 h內(nèi)顯著高于菌液對照組(P0.05)。結(jié)果表明皮寒藥乙酸乙酯部位對金葡菌細(xì)胞膜滲透性無影響,在藥物作用前期,可增大細(xì)胞壁的通透性。對葡萄糖含量變化測定結(jié)果顯示,1 MIC、1/2 MIC和1/4 MIC藥物濃度組培養(yǎng)液中所剩葡萄糖含量在4 h、6 h、8 h顯著高于0 MIC(P0.01)。0 MIC組金葡菌在6 h內(nèi)消耗完培養(yǎng)液中的葡萄糖,而1/2 MIC和1/4 MIC組在10 h后消耗完畢,1 MIC組10 h后培養(yǎng)液中仍含有葡萄糖。結(jié)果表明皮寒藥乙酸乙酯部位的1 MIC、1/2 MIC和1/4 MIC三個(gè)藥物濃度能顯著抑制金葡菌對葡萄糖的利用。對糖代謝相關(guān)酶活的檢測結(jié)果顯示,在第1 h、3 h、5 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)1 MIC藥物組琥珀酸脫氫酶和乳酸脫氫酶活性均低于0 MIC組,其中乳酸脫氫酶活性在這兩組間差異極顯著(P0.01),琥珀酸脫氫酶活性在第1 h和3 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩組間差異極顯著(P0.01)。結(jié)果表明皮寒藥乙酸乙酯部位1 MIC濃度藥物可極顯著抑制金葡菌乳酸脫氫酶和琥珀酸脫氫酶的活性。對金葡菌可溶性蛋白含量的檢測結(jié)果顯示,在3 h、5 h、7 h三個(gè)檢測時(shí)間點(diǎn),1 MIC藥物組金葡菌可溶性蛋白濃度均低于菌液對照組,在3 h、5 h兩個(gè)檢測時(shí)間點(diǎn)差異極顯著(p0.01),在第7 h差異顯著(p0.05)。第3 h,1 MIC組菌體可溶性蛋白濃度比菌液對照組降低了42.54%,第5 h降低了17.78%,第7 h降低了15.87%。結(jié)果表明皮寒藥乙酸乙酯部位1 MIC濃度藥物能抑制金葡菌可溶性蛋白質(zhì)的表達(dá)。試驗(yàn)結(jié)果提示:皮寒藥乙酸乙酯部位能干擾金葡菌的能量代謝過程和可溶性蛋白質(zhì)的表達(dá),在藥物作用前期能影響菌體細(xì)胞壁通透性。3.皮寒藥乙酸乙酯部位對金黃色葡萄球菌抑制作用的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析本研究通過對皮寒藥乙酸乙酯部位作用組和正常對照組的金葡菌轉(zhuǎn)錄本信息進(jìn)行測序比較,結(jié)果共獲得195個(gè)差異表達(dá)基因(FC≥2,P0.05),與對照組相比,皮寒藥作用組金葡菌轉(zhuǎn)錄本中101個(gè)基因表達(dá)上調(diào),94個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。其中皮寒藥作用組金葡菌的蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因:50S核糖體蛋白質(zhì)L27、50S核糖體蛋白質(zhì)L25、50S核糖體蛋白L15、核糖體RNA大亞基甲基轉(zhuǎn)移酶、延伸因子G基因表達(dá)顯著下調(diào)(P0.05)。有14個(gè)差異表達(dá)基因顯著富集在氨基酸生物合成過程,其中5個(gè)與天冬氨酸鹽家族氨基酸生物合成過程有關(guān),基因lysC(編碼天冬氨酸激酶)、thrC(編碼蘇氨酸合酶)、metE(編碼同型半胱氨酸-S-甲基轉(zhuǎn)移酶)、dapH(編碼N-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶)表達(dá)上調(diào),基因lysA(編碼二氨基二庚酸脫羧酶)表達(dá)下調(diào)。嘌呤生物合成過程中,編碼次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因、脫氧鳥苷激酶基因、甘氨酸連接酶基因表達(dá)下調(diào),同時(shí),催化嘌呤核苷磷酸解反應(yīng)的嘌呤核苷磷酸化酶基因表達(dá)上調(diào)。此外,葉酸生物合成過程中聚谷氨酸合成酶、嘧啶代謝過程中的嘧啶核苷磷酸化酶基因均表達(dá)下調(diào)。測序結(jié)果顯示差異基因在果糖-甘露糖代謝途徑存在顯著富集,果糖-二磷酸醛縮酶和L-艾杜糖醇-2-脫氫酶基因表達(dá)下調(diào)。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)家族成員亞精胺/腐胺ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、寡肽ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、鐵復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、鐵/鋅/錳/銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、鎳轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、磷壁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的跨膜通道蛋白基因表達(dá)上調(diào)。細(xì)胞壁合成相關(guān)基因,mrcA(編碼青霉素結(jié)合蛋白1A)、murB(編碼UDP-N-乙酰胞壁酸脫氫酶)、sgtA(轉(zhuǎn)糖苷酶基因)、tagB(編碼磷壁酸生物合成蛋白質(zhì))表達(dá)上調(diào)。此外,多種毒力因子:表皮剝脫毒素A(Exfoliative toxin A)、凝集因子(Clumping factor)、殺白細(xì)胞素(Pantonvalentine leucocidin,PVL)以及與多糖細(xì)胞間黏附素(Polysaccharide intercellular adhesion,PIA)形成具有密切聯(lián)系的icaR、icaC基因均表達(dá)下調(diào)。以熒光定量PCR對10個(gè)差異表達(dá)的基因進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示這些基因的表達(dá)變化趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果基本一致。試驗(yàn)結(jié)果表明皮寒藥作用于金葡菌1 h,差異表達(dá)基因主要集中在代謝過程、催化活性、細(xì)胞過程、蛋白結(jié)合和毒力因子表達(dá)上。提示皮寒藥可下調(diào)金葡菌相關(guān)毒力因子的表達(dá),上調(diào)細(xì)胞壁合成相關(guān)基因的表達(dá),影響氨基酸代謝、糖代謝、嘌呤嘧啶代謝過程相關(guān)酶基因的表達(dá),并可能通過下調(diào)金葡菌核糖體相關(guān)編碼基因及延伸因子的基因表達(dá)干擾菌體細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成過程。綜上,本研究表明皮寒藥乙酸乙酯部位對金葡菌具有抑菌和殺菌活性,可通過干擾金葡菌能量代謝過程和可溶性蛋白質(zhì)的表達(dá),抑制金葡菌的正常生長和繁殖。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明皮寒藥作用下,金葡菌差異表達(dá)基因主要集中在代謝過程,催化活性、細(xì)胞過程、蛋白結(jié)合和毒力因子表達(dá)上,皮寒藥對金葡菌的抑制作用可能與這些基因表達(dá)的顯著性變化有關(guān)。
[Abstract]:Staphylococcus aureus is a kind of food - borne pathogenic bacteria , not only threatens food hygiene safety seriously , but also has serious harm in animal production . In medicine and veterinary medicine , Staphylococcus aureus often causes infection of human and animal pyogenic infection . With the clinical detection rate of Methicilin - resistant Staphylococcus aureus ( MRSA ) , it has become a global health problem . The minimal inhibitory concentration ( MIC ) and minimal bactericidal concentration ( MBC ) of Staphylococcus aureus were studied . The results and conclusions were as follows : 1 . The concentration of bacterial solution at 2 , 4 , 6 , 10 h was significantly lower than that of control group and 1 / 4 MIC group ( P0.01 ) . The concentration of MIC in the group of 2 , 4 , 6 , 10 h was significantly lower than that of control group ( P0.01 ) . The results showed that the concentration of 1 MIC , 1 / 2 MIC and 1 / 4 MIC in 1 MIC , 1 / 2 MIC and 1 / 4 MIC group were significantly higher than that of control group ( P0.01 ) . The results showed that the expression of the gene was down - regulated by the expression of the gene lysC ( coded aspartate kinase ) , thrC ( coded threonine synthase ) , metE ( coding homocysteic - S - methyl transferase ) , gene lysA ( coded N - succinyltransferase ) , metE ( coding homocysteic - S - methyl transferase ) , gene lysA ( coded N - succinyltransferase ) .

【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S853.7

【參考文獻(xiàn)】

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1 黃琦;屈玟珊;高世軍;馬俊琳;劉龍?jiān)?徐麟;馬鴻雁;;苦參生物堿和黃酮體外抑菌活性比較[J];廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào);2016年05期

2 松長青;周本宏;易慧蘭;吳s，

本文編號(hào)：1748826