本文選題：旋毛蟲　切入點(diǎn)：腫瘤相關(guān)抗原　出處：《吉林大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目前國內(nèi)外許多研究已經(jīng)證實(shí),旋毛蟲感染對動(dòng)物體內(nèi)的腫瘤生長具有抑制作用,但其具體抗腫瘤機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)室先前通過對旋毛蟲c DNA文庫的篩選,已發(fā)現(xiàn)旋毛蟲與乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、肺癌等多種癌細(xì)胞存在相關(guān)抗原,并且針這些相關(guān)抗原所制備的鼠源高免血清和單克隆抗體均在裸鼠荷瘤模型的治療實(shí)驗(yàn)中取得了較好的抗腫瘤作用。其中本實(shí)驗(yàn)室前期以旋毛蟲與A549肺癌細(xì)胞相關(guān)抗原旋毛蟲7TR蛋白為抗原制備的鼠源高免血清,在裸鼠荷A549的腫瘤動(dòng)物模型的治療實(shí)驗(yàn)中,取得了64.77%的抑瘤率。左紹志等利用旋毛蟲與肝癌的相關(guān)抗原制備的單抗,也在H7402的腫瘤動(dòng)物模型的治療實(shí)驗(yàn)中獲得了良好的治療效果。但是,鼠源抗體因?yàn)楦甙旱某杀径y以大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。更重要的是,鼠源抗體在疾病治療中還沒達(dá)到滿意的效果,多克隆抗體和單克隆抗體都會(huì)在人體引起較強(qiáng)的人抗鼠抗體(human anti-mouse antibody,HAMA)反應(yīng);而嵌合抗體和CDR移植抗體等改型抗體也存在著治療效果有限、排斥反應(yīng)和技術(shù)復(fù)雜等問題。Huston J S等和Bird R等采用DNA重組技術(shù)制備的單鏈抗體(sc Fv),具有完整的抗原結(jié)合位點(diǎn),分子量只有常規(guī)抗體的約1/6,穿透組織能力強(qiáng),在血液中代謝清除快,全部篩選過程可在體外進(jìn)行。更重要的是sc Fv能在工程菌中表達(dá),易于基因改造和規(guī)�；a(chǎn),并可連接抗腫瘤效應(yīng)分子,構(gòu)建抗腫瘤融合蛋白,從而將藥物導(dǎo)向腫瘤,在腫瘤顯像和腫瘤靶向性治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。近幾年報(bào)道中,已有人將單鏈抗體直接用于實(shí)體瘤治療的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,并取得了較好的治療效果,這也證明了單鏈抗體藥物新的應(yīng)用潛力。本實(shí)驗(yàn)首先對旋毛蟲與肺癌A549細(xì)胞相關(guān)抗原旋毛蟲7TR蛋白進(jìn)行原核表達(dá),表達(dá)后的重組蛋白經(jīng)純化、復(fù)性后,進(jìn)行了Tomlinson(I+J)人源單鏈抗體庫的的篩選,并用ELISA驗(yàn)證篩選所得陽性抗體分泌菌株。對陽性抗體分泌株所分泌抗體進(jìn)行純化后,采用間接免疫熒光抗體檢驗(yàn)陽性抗體與A549細(xì)胞的結(jié)合活性,并采用CCK-8法度檢測不同濃度的抗體對A549細(xì)胞的生長抑制活性。最后通過荷瘤裸鼠的治療實(shí)驗(yàn)評價(jià)抗旋毛蟲7TR蛋白人源單鏈抗體對A549肺癌腫瘤細(xì)胞的治療效果,通過免疫組化分析單鏈抗體抑制A549細(xì)胞的機(jī)制。旋毛蟲7TR蛋白的原核表達(dá)、純化與復(fù)性根據(jù)NCBI公布的旋毛蟲7TR基因,設(shè)計(jì)特異性引物,以旋毛蟲c DNA為模板,PCR擴(kuò)增目的基因,并將目的基因克隆到p ET-32a載體,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。對表達(dá)蛋白進(jìn)行DEAE弱離子交換柱柱上復(fù)性,并對復(fù)性后蛋白進(jìn)行Cu2+螯合柱親合層析,最后得到純化并復(fù)性的重組旋毛蟲7TR蛋白。Tomlinson(I+J)人源單鏈?zhǔn)删w抗體庫的篩選經(jīng)過四輪針對7TR蛋白的噬菌體抗體富集后,隨機(jī)挑選2000個(gè)侵染了噬菌體的E.coli HB2151單菌落,通過IPTG誘導(dǎo)后取得的上清,經(jīng)ELISA檢驗(yàn),當(dāng)樣品OD490試≥3OD490陰時(shí),視樣品為陽性,進(jìn)過三輪平行驗(yàn)證以及對p ET-32a標(biāo)簽抗體和奶粉抗體的去除,此過程中最終共篩選出9株陽性克隆:1A2、2B1、2B8、4C7、5D1、6D2、7H5、7H9、8G5。經(jīng)ELISA初步檢測,其中只有8G5具有較好的A549結(jié)合活性。7TR陽性抗體的A549結(jié)合活性檢測純化8G5抗體后,通過激光共聚焦觀察間接免疫熒光結(jié)果,發(fā)現(xiàn)8G5單鏈抗體具有較好的A549結(jié)合活性。經(jīng)Ig blast分析,8G5為完整的人源單鏈抗體。7TR蛋白人源單鏈抗體體內(nèi)外抗A549腫瘤作用采用CCK-8法檢測抗旋毛蟲7TR蛋白人源單鏈抗體的體外抗A549肺癌作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)單鏈抗體對A549細(xì)胞的最高生長抑制率為23.29%。體內(nèi)抗A549腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,單鏈抗體的最高抑瘤率為59.10%。利用免疫組化分析抗旋毛7TR人源單鏈抗體治療后腫瘤組織癌細(xì)胞增殖凋亡相關(guān)基因PCNA、VEGF、Bcl-2的表達(dá)情況,結(jié)果表明經(jīng)旋毛蟲7TR人源單鏈抗體治療后,PCNA、VEGF表達(dá)均下調(diào),Bcl-2基因表達(dá)無明顯變化。并且,HE染色結(jié)果顯示,7TR單鏈抗體在治療A549腫瘤后,裸鼠的心、肝、脾、肺、腎均未出現(xiàn)病理組織學(xué)變化。
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【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S852.7

【參考文獻(xiàn)】

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1 施博文;喬文亮;韓玉棟;胡海洋;陳s，

本文編號：1700423