本文選題：蘭州百合　切入點(diǎn)：蔗糖合成酶　出處：《沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：淀粉含量是決定百合種球質(zhì)量的最關(guān)鍵因素。蔗糖作為百合鱗莖中可溶性碳水化合物的主要形態(tài),可在蔗糖合成酶(Sucrose Synthase,SuSy)和可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶(Soluble Acid Invertase,SAI)調(diào)控下參與淀粉合成。為探究百合SuSy和SAI的基因功能及其在蔗糖-淀粉代謝途徑中的調(diào)節(jié)機(jī)理,本研究首先克隆得到蘭州百合(Lilium davidiivar.unicolor)兩個(gè)SuSy基因SuSy1和SuSy2的全長(zhǎng)cDNA序列,并對(duì)其序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,將其過(guò)表達(dá)載體和RNAi載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化蘭州百合。而后構(gòu)建了蘭州百合SuSy及SAI基因的原核表達(dá)載體,并在適宜條件誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá),為進(jìn)一步研究百合SuSy和SAI基因功能奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:1.SuSy1和SuSy2基因cDNA全長(zhǎng)克隆及生物信息學(xué)分析以蘭州百合扦插鱗片的總RNA為模板,采用RT-PCR及RACE法成功克隆獲得SuSy基因SuSy1和SuSy2全長(zhǎng)cDNA序列,其長(zhǎng)度分別為2,877 bp和2,865 bp.序列分析結(jié)果顯示,基因SuSy1和SuSy2的同源性為85.73%,與同科植物同源性為65%-88%,分別編碼807和810個(gè)氨基酸,其蛋白等電點(diǎn)均為6.10.結(jié)構(gòu)域分析表明,SuSy1和SuSy2均編碼含有188個(gè)氨基酸的保守結(jié)構(gòu)域,其中包含一個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域,與糖基轉(zhuǎn)化酶家族GT1有很高的相似性。2.SuSy基因轉(zhuǎn)化蘭州百合研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法,將帶有蘭州百合SuSy1和SuSy2基因的過(guò)表達(dá)載體和RNAi載體導(dǎo)入蘭州百合。為優(yōu)化遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程,進(jìn)行了蘭州百合小鱗片對(duì)潮霉素(Hyg)和頭孢霉素(Cef)濃度敏感試驗(yàn),并對(duì)影響轉(zhuǎn)化的各因素進(jìn)行篩選。獲得最適條件為:20 mg L-1 Hyg為抗性芽篩選的適宜濃度;300 mg L-1 Cef為最適抑菌濃度;預(yù)培養(yǎng)2 d,農(nóng)桿菌菌液培養(yǎng)至OD600為0.6,侵染鱗片20 min,重懸液和共培養(yǎng)基中加入終濃度為100 μM的乙釀丁香酮(AS),共培養(yǎng)3 d.最終獲得了 3株帶有基因SuSy2片段的RNAi載體的轉(zhuǎn)基因抗性苗,目前正處于篩選階段。3.構(gòu)建原核表達(dá)載體及基因原核表達(dá)利用雙酶切法,將蘭州百合SuSy基因SuSy1、SuSy2和SAI基因SAI的ORF序列與原核表達(dá)載體pET28a酶切并連接,構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-28a-SuSy1、pET-28a-SuSy2和pET-28a-SAI.將獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入原核表達(dá)菌株BL21(DE3),加入IPTG誘導(dǎo),且從誘導(dǎo)溫度和IPTG濃度方面獲得適宜誘導(dǎo)條件,經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè),結(jié)果表明,目的基因得到的融合蛋白與試驗(yàn)預(yù)期的大小相一致,可以初步認(rèn)定SuSy和SAI基因在原核中獲得表達(dá)。
[Abstract]:Starch content is the most important factor to determine the quality of lily bulb. Sucrose is the main form of soluble carbohydrate in lily bulb. Under the regulation of sucrose synthase Sucrose Synthase SuSyand soluble acid invertase (Soluble Acid InvertaseSae), starch synthesis could be involved in starch synthesis. In order to study the gene function of SuSy and SAI and its regulation mechanism in sucrose-starch metabolism, In this study, the full-length cDNA sequences of two SuSy genes, SuSy1 and SuSy2, were first cloned from Lilium davidiivar.unicolor, and their sequences were analyzed by bioinformatics. The overexpression vector and RNAi vector were transformed into Lanzhou lily by Agrobacterium tumefaciens. The prokaryotic expression vector of SuSy and SAI gene was constructed, and the fusion protein expression was induced under suitable conditions. The main results are as follows: 1. The full-length cloning of SuSy1 and SuSy2 gene cDNA and bioinformatics analysis were based on the total RNA of cuttage scale of Lanzhou Lily. The full-length cDNA sequences of SuSy gene SuSy1 and SuSy2 were successfully cloned by RT-PCR and RACE. The length of cDNA was 2877 BP and 2865 BP, respectively. The results showed that the homology of SuSy1 and SuSy2 was 85.73, and the homology of SuSy1 and SuSy2 was 65-88, encoding 807 and 810 amino acids, respectively. The protein isoelectric point is 6.10.The domain analysis shows that SuSy1 and SuSy2 both encode a conserved domain containing 188 amino acids, including a glycosyltransferase domain. SuSy gene was transformed into Lanzhou lily by Agrobacterium tumefaciens mediated transformation. The overexpression vector and RNAi vector containing SuSy1 and SuSy2 genes were introduced into Lanzhou lily. In order to optimize the genetic transformation process, the suSy gene was transformed into Lilium Lanzhou by Agrobacterium tumefaciens (Agrobacterium tumefaciens). The sensitivity test of Lilium lilium scale to hygromycin (Hyg) and cefomycin (Cef) concentration was carried out, and the factors affecting transformation were screened. The optimum conditions were as follows: 1. 20 mg L-1 Hyg was the optimum concentration for screening resistant buds, and 300 mg L-1 Cef was the optimum inhibitory concentration. After 2 days of pre-culture, Agrobacterium tumefaciens were cultured to OD600 0.6, infecting scales for 20 min, adding 100 渭 M final concentration of eugenone to the culture medium for 3 days. Finally, three RNAi vectors with gene SuSy2 fragment were obtained. Transgenic resistant seedlings, At present, the prokaryotic expression vector and prokaryotic expression vector were constructed. The ORF sequences of SuSy gene SuSy1SuSy2 and SAI gene SAI were digested and ligated with the prokaryotic expression vector pET28a by double enzyme digestion. The prokaryotic expression vectors pET-28a-SuSy1, pET-28a-SuSy2 and pET-28a-SAI. were transformed into the prokaryotic expression strain BL21DE3 and induced by IPTG. The suitable induction conditions were obtained from the induction temperature and the concentration of IPTG. The results of SDS-PAGE electrophoresis showed that, The fusion protein obtained from the target gene was consistent with the expected size of the experiment, and the expression of SuSy and SAI genes in prokaryotic cells could be preliminarily identified.
【學(xué)位授予單位】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S682.29

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