本文選題：小反芻獸疫　切入點(diǎn)：病毒分離　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：小反芻獸疫(Pestedes petits ruminants,PPR)主要發(fā)生在發(fā)展中國家,嚴(yán)重危害養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展,其跨境傳播能力強(qiáng),致死率最高可達(dá)100%。我國目前報道的小反芻獸疫病毒(Pestedes petits ruminants virus,PPRV)流行毒株主要集中于西藏和新疆等養(yǎng)羊業(yè)比較集中的地區(qū),其它地區(qū)的流行毒株少有報道。本研究對2014年從浙江富陽分離的一株P(guān)PRV流行毒株(FY株)進(jìn)行了分離和鑒定,同時對其全基因組進(jìn)行了測序和分析,以期為我國PPRV分子流行病學(xué)研究提供新的參考資料,并豐富PPRV基因庫,這將有助于分析病毒變異狀況,研究PPRV在我國的遺傳背景等信息,選擇適合的疫苗以及研發(fā)新型疫苗。本論文內(nèi)容包括以下3個方面。1、PPRV FY株的分離和鑒定:將從浙江省富陽市采集的PPRV病料進(jìn)行研磨,經(jīng)離心、除菌后,分別接種于長滿單層的Vero細(xì)胞、BHK細(xì)胞及CV細(xì)胞(CV)。培養(yǎng)96h后,收集細(xì)胞培養(yǎng)物,再在上述細(xì)胞中盲傳3-5代。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PPRV FY株在vero細(xì)胞和BHK細(xì)胞中均沒有明顯細(xì)胞病變出現(xiàn),但是在CV細(xì)胞中出現(xiàn)典型細(xì)胞病變,主要表現(xiàn)為:細(xì)胞變圓、脫落、出現(xiàn)合胞體。待細(xì)胞出現(xiàn)80%左右病變時,收獲細(xì)胞培養(yǎng)物,然后分別使用RT-PCR、Western Blot、間接免疫熒光及電鏡負(fù)染等方法對病毒分離物進(jìn)行鑒定。檢測結(jié)果表明,從CV細(xì)胞培養(yǎng)物中能特異性地檢測到PPRV的基因組,Western Blot、間接免疫熒光檢測結(jié)果均證明用CV細(xì)胞分離到的病毒可與PPRV單抗F發(fā)生特異性反應(yīng)。將收獲的CV細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行超速離心,純化出病毒,然后用電子顯微鏡進(jìn)行觀察,可以看到具有囊膜的,直徑在150-300nm之間的病毒顆粒,符合已報道的PPRV病毒顆粒形態(tài)學(xué)特征。上述研究結(jié)果證明,我們成功應(yīng)用CV細(xì)胞分離到了PPRV,并將其命名為FY株。2、PPRV FY株N基因的原核表達(dá)及多抗的制備:擴(kuò)增PPRV FY株N基因序列,連接到pET-32a載體上測序分析,測序正確后轉(zhuǎn)化到(E.coli)BL21(DE3)菌株中,IPTG誘導(dǎo),表達(dá)重組N蛋白,并采用包涵體純化的方法純化重組蛋白,將純化蛋白免疫實(shí)驗(yàn)兔,制備多克隆抗體,并使用WesternBlot及間接免疫熒光等方法對得到的多抗進(jìn)行鑒定,結(jié)果表明所制備多抗特異性良好并可用于PPRV的初步檢測。3、PPRV FY株的全基因組序列測定及分析:根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的PPRV參考毒株序列,設(shè)計了 11對特異性擴(kuò)增引物,然后用RT-PCR方法分段擴(kuò)增出PPRV FY株的全基因組序列,應(yīng)用DNAstar軟件和MEGA軟件對PPRV FY株及參考毒株的基因序列進(jìn)行了比對和分析,并根據(jù)N基因核苷酸序列繪制了系統(tǒng)進(jìn)化樹。試驗(yàn)結(jié)果表明PPRVFY株基因組全長為15948nt,推測編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白(N、P、L、M、F和H),2種非結(jié)構(gòu)蛋白(C和V),PPRV各毒株轉(zhuǎn)錄起始序列和轉(zhuǎn)錄終止序列都高度保守。同源性比較分析結(jié)果顯示,PPRVFY株與科特迪瓦來源毒株具有最低的同源性,然而與西藏來源毒株具有最高同源性,其基因間隔區(qū)N-P長度一致,相似度最高,而M-F相似度最低,通過比較PPRVFY株與參考毒株基因組末端調(diào)控序列,還可以看出在整個麻疹病毒屬GP區(qū)和AGP區(qū)保守性較高,且存在不同程度的互補(bǔ)。氨基酸序列分析結(jié)果揭示PPRVFY株在保守區(qū)域出現(xiàn)21處氨基酸突變,這些突變對其所編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能有何影響尚需要進(jìn)一步研究。根據(jù)PPRV N基因序列,我們對PPRV FY株及參考毒株進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),PPRVFY株與其它亞洲源PPRV野毒株共同形成一個拓?fù)淙?屬于第IV譜系。綜上所述,本研究成功分離到了 2014年流行于浙江省的PPRV流行毒株FY株,該毒株對細(xì)胞的適應(yīng)性不強(qiáng),僅能在表達(dá)其受體基因的細(xì)胞系中增殖。在此基礎(chǔ)上,我們完成了對其全基因組序列的測定、N基因的原核表達(dá)及生物信息學(xué)分析,證明PPRVFY株屬于基因IV型,并且與疫苗株的同源性較低,但與我國報道的其它野毒株具有較高同源性。
[Abstract]:Peste des petits ruminants (Pestedes petits ruminants, PPR) occurs mainly in developing countries, serious harm to the development of sheep industry and the cross-border transmission capacity, the highest mortality rate of up to 100%. in China currently reported PPRV (Pestedes petits ruminants virus, PPRV) strains are mainly concentrated in the Tibet and Xinjiang sheep the industry is relatively concentrated areas, other areas of the epidemic strains are rarely reported. The study on 2014 Fuyang strain isolated from Zhejiang PPRV strains (FY strain) were isolated and identified, and the whole genome was sequenced and analyzed, in order to provide reference for the study of new China PPRV molecular epidemiology PPRV, and enrich the gene pool, which will be helpful to analyze the virus mutation status, research in China PPRV genetic background information, select the appropriate vaccine and develop new vaccines. The content of this thesis includes the following 3 aspects of.1, isolation and identification of PPRV FY strain: from Zhejiang city of Fuyang province collected PPRV samples were ground by centrifugation, after sterilization, were inoculated into full monolayer Vero cells, BHK cells and CV cells (CV). After 96h culture, collecting cell cultures, and then in the above cells in 3-5 blind passages. The results showed that PPRV FY strain in Vero cells and BHK cells were no obvious cell lesions, but in CV cells showed typical cell pathological changes, the main performance is: the cells became round, shedding appears syncytial cells appeared to be. 80% lesions, harvest cell culture then, using RT-PCR, Western Blot, indirect immunofluorescence and electron microscopy negative staining method for identification of isolates of the virus. The detection results show that the compound can specifically detect PPRV genome, Western Blot from CV cell culture, indirect immunofluorescence test results showed that with CV cells The isolated virus with PPRV monoclonal antibody F specific reaction. After CV cell culture by centrifugation, and purified virus, and then was examined by electron microscopy, can be seen with the capsule, the diameter between 150-300nm particles with morphological features of PPRV virus particles have been reported the results of the study. We proved that the successful application of CV cells to PPRV, and named FY strain.2, prokaryotic expression and polyclonal antibody of N gene of PPRV strain FY preparation: FY amplification of PPRV N gene sequence analysis, connected to pET-32a vector and sequencing, sequencing and transformed into (E.coli) BL21 (DE3) IPTG induced strains, and expression of recombinant N protein, and the method of purification of inclusion body of recombinant protein, the purified protein immunized rabbit, polyclonal antibody, and using WesternBlot and indirect immunofluorescence method to obtain the polyclonal antibody into For identification, the results show that the preparation of the preliminary detection of.3 antibody and PPRV can be used for the determination and analysis of the complete genome sequence of PPRV strain FY PPRV reference strains: according to the published sequence, designed 11 pairs of primers, and then use the RT-PCR method to expand the segmented genome of PPRV FY strain the application of DNAstar software and MEGA software of PPRV FY strains and reference strains of the gene sequence was compared and analyzed, and draw the phylogenetic tree based on the nucleotide sequence of N gene. The experimental results showed that the full-length genome of PPRVFY strain was 15948nt, speculated that the 6 structural proteins (N, P, encoding L, M, F and H 2), non structural proteins (C and V), PPRV strains transcription initiation sequence and transcription termination sequences are highly conserved. Homology analysis showed that PPRVFY strain and strain with the lowest homology from Ivory Coast, but with Tibet source of poison Strains with the highest homology, the length of the intergenic region N-P and M-F, the highest similarity, the lowest similarity, through the comparison of the PPRVFY strains and the reference strains genome end regulatory sequences can also be seen in the measlesvirus GP conservation area and AGP area is high, and does not have the same degree of complementary amino acid sequence analysis revealed PPRVFY. In 21 strains of conserved regions of amino acid mutations, these mutations on the structure and function of the protein encoding impact still needs further research. According to the PPRV sequence of N gene, we performed phylogenetic analysis of PPRV FY strains and reference strains. The results showed that PPRVFY strain and other Asian wild strains together form the source PPRV a topological group belongs to the IV lineage. In conclusion, PPRV strains FY strains in this study successfully isolated the 2014 popular in Zhejiang Province, the strain on cell compatibility is not Strong proliferation only in its receptor gene expression in cell lines. On this basis, we have completed the determination of the whole genome sequence analysis, prokaryotic expression and biological information of N gene, that PPRVFY belonged to genotype IV, and vaccine strains with low homology, but other wild strains reported in China and has a high homology.

【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S852.65

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