本文選題：奶牛乳腺上皮細(xì)胞　切入點(diǎn)：bta-miR-33a　出處：《吉林大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：本文依據(jù)microRNA(以下簡稱miRNA)在組織或細(xì)胞內(nèi)可特異性結(jié)合靶基因3’UTR的靶標(biāo)位點(diǎn)并調(diào)控其表達(dá)從而發(fā)揮生物學(xué)功能,通過驗(yàn)證miRNA在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中與候選靶基因的靶標(biāo)關(guān)系,為探討其調(diào)控乳脂代謝的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)室前期利用高通量測序及其生物信息學(xué)分析技術(shù)分別對高乳脂率和低乳脂率乳腺中miRNA的表達(dá)模式進(jìn)行鑒定,分析得到bta-miR-33a具有差異表達(dá)性,且在低乳脂率乳腺中低表達(dá),在高乳脂率乳腺中高表達(dá)。通過靶基因預(yù)測和KEGG功能注釋等生物學(xué)分析技術(shù)以及試驗(yàn)驗(yàn)證手段,篩選出bta-miR-33a的候選靶基因及與乳脂代謝調(diào)控相關(guān)的基因。因此,本研究利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)對bta-miR-33a的候選靶基因ELOVL6、HADHB進(jìn)行驗(yàn)證,再在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)染bta-miR-33a的模擬物,檢測bta-miR-33a與預(yù)測靶基因在細(xì)胞中的表達(dá)水平關(guān)系,并利用生物學(xué)試驗(yàn)手段進(jìn)一步探究bta-miR-33a在乳腺上皮細(xì)胞中對調(diào)控乳脂代謝的相關(guān)基因的影響。首先,利用雙熒光素酶報(bào)告基因法驗(yàn)證bta-miR-33a與候選靶基因ELOVL6、HADHB的靶標(biāo)關(guān)系。通過miRbase及Targetscan對候選靶基因的ELOVL6、HADHB 3’UTR區(qū)進(jìn)行預(yù)測分析,顯示在ELOVL6 3’UTR(1132-1138bp)、HADHB 3’UTR(61-67bp)與bta-miR-33a種子區(qū)域(CAATGCA)存在特異性結(jié)合的靶標(biāo)位點(diǎn)。將其克隆到pmiR-RB-REPORT?雙熒光素酶報(bào)告載體中,獲得野生型載體(pmiR-RB-REPORT-ELOVL6 WT;pmiR-RB-REPORT-HADHB-WT);利用定點(diǎn)突變技術(shù)將ELOVL6和HADHB3’UTR種子區(qū)-CAATGCA定點(diǎn)突變-CATGTAGC,獲得突變型載體(pmiR-RB-REPORT-ELOVL6 mut;pmiR-RB-REPORT-HADHB-mut)。將ELOVL6和HADHB的野生型載體、突變型載體及其空載分別與bta-miR-33a-mimics共轉(zhuǎn)染至奶牛乳腺上皮細(xì)胞,并測定其熒光活性。結(jié)果:bta-miR-33a顯著降低了ELOVL6和HADHB的野生型載體雙熒光素酶活性,并顯著低于突變型及空載體組;而突變型組及空載體組之間的熒光值差異不顯著。結(jié)論:在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中bta-miR-33a可以與ELOVL6、HADHB 3’UTR的靶位點(diǎn)-CAATGCA特異性結(jié)合,ELOVL6、HADHB基因的3’UTR區(qū)存在bta-miR-33a的靶位點(diǎn)。然后,將bta-miR-33a mimics、bta-miR-33a inhibitor及NC質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至奶牛乳腺上皮細(xì)胞,通過實(shí)時(shí)熒光定量驗(yàn)證bta-miR-33a與ELOVL6、HADHB m RNA水平表達(dá)量的關(guān)系,并且利用western bolt對ELOVL6及HADHB蛋白水平檢測進(jìn)一步驗(yàn)證。結(jié)果:以轉(zhuǎn)染NC組為實(shí)驗(yàn)對照,bta-miR-33a mimics組中bta-miR-33a的表達(dá)量明顯高于bta-miR-33a inhibitor組;而ELOVL6、HADHB的表達(dá)量在bta-miR-33a mimics組中顯著下降,在bta-miR-33a inhibitor組中表達(dá)量顯著升高。結(jié)論:在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中bta-miR-33a下調(diào)ELOVL6、HADHB的表達(dá),進(jìn)一步驗(yàn)證了ELOVL6、HADHB是bta-miR-33a的靶基因。最后,利用生物試驗(yàn)方法進(jìn)一步探究bta-miR-33a對奶牛乳腺上皮細(xì)胞中乳脂代謝相關(guān)基因的調(diào)控。一方面,細(xì)胞轉(zhuǎn)染后提取總RNA和總蛋白,檢測脂肪酸生物合成通路中與乳脂代謝相關(guān)基因CPTIA、SC4MOL,PTPLB,ALOX15的表達(dá)水平。結(jié)果:與NC組對比,轉(zhuǎn)染bta-miR-33a mimics組中CPTIA、SC4MOL,PTPLB的表達(dá)量低于bta-miR-33a inhibitor組,而ALOX15的表達(dá)量在bta-miR-33a mimics組中顯著高于bta-miR-33a inhibitor組。利用Western bolt對基因ALOX15蛋白水平檢測進(jìn)一步驗(yàn)證得到,在bta-miR-33a mimics組中ALOX15表達(dá)量顯著增加,在bta-miR-33a inhibitor組中ALOX15表達(dá)量顯著降低。另一方面,在細(xì)胞中通過檢測甘油三酯含量的變化可以衡量乳脂代謝的變化。將bta-miR-33a mimics、bta-miR-33a inhibitor及NC質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至奶牛乳腺上皮細(xì)胞,收集細(xì)胞,通過試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的變化。結(jié)果:與轉(zhuǎn)染NC組對照,轉(zhuǎn)染bta-miR-33a mimics組中,bta-miR-33a的過表達(dá)促進(jìn)了甘油三酯的合成,而bta-miR-33a inhibitor組內(nèi)甘油三酯的合成顯著降低。結(jié)論:bta-miR-33a可作為探討奶牛乳腺調(diào)控機(jī)制的miRNA。
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【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S823

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1613296