本文選題：奶牛乳腺上皮細胞　切入點：bta-miR-33a　出處：《吉林大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：本文依據(jù)microRNA(以下簡稱miRNA)在組織或細胞內(nèi)可特異性結(jié)合靶基因3’UTR的靶標位點并調(diào)控其表達從而發(fā)揮生物學功能,通過驗證miRNA在奶牛乳腺上皮細胞中與候選靶基因的靶標關系,為探討其調(diào)控乳脂代謝的分子機制提供理論基礎。實驗室前期利用高通量測序及其生物信息學分析技術分別對高乳脂率和低乳脂率乳腺中miRNA的表達模式進行鑒定,分析得到bta-miR-33a具有差異表達性,且在低乳脂率乳腺中低表達,在高乳脂率乳腺中高表達。通過靶基因預測和KEGG功能注釋等生物學分析技術以及試驗驗證手段,篩選出bta-miR-33a的候選靶基因及與乳脂代謝調(diào)控相關的基因。因此,本研究利用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)對bta-miR-33a的候選靶基因ELOVL6、HADHB進行驗證,再在奶牛乳腺上皮細胞中轉(zhuǎn)染bta-miR-33a的模擬物,檢測bta-miR-33a與預測靶基因在細胞中的表達水平關系,并利用生物學試驗手段進一步探究bta-miR-33a在乳腺上皮細胞中對調(diào)控乳脂代謝的相關基因的影響。首先,利用雙熒光素酶報告基因法驗證bta-miR-33a與候選靶基因ELOVL6、HADHB的靶標關系。通過miRbase及Targetscan對候選靶基因的ELOVL6、HADHB 3’UTR區(qū)進行預測分析,顯示在ELOVL6 3’UTR(1132-1138bp)、HADHB 3’UTR(61-67bp)與bta-miR-33a種子區(qū)域(CAATGCA)存在特異性結(jié)合的靶標位點。將其克隆到pmiR-RB-REPORT?雙熒光素酶報告載體中,獲得野生型載體(pmiR-RB-REPORT-ELOVL6 WT;pmiR-RB-REPORT-HADHB-WT);利用定點突變技術將ELOVL6和HADHB3’UTR種子區(qū)-CAATGCA定點突變-CATGTAGC,獲得突變型載體(pmiR-RB-REPORT-ELOVL6 mut;pmiR-RB-REPORT-HADHB-mut)。將ELOVL6和HADHB的野生型載體、突變型載體及其空載分別與bta-miR-33a-mimics共轉(zhuǎn)染至奶牛乳腺上皮細胞,并測定其熒光活性。結(jié)果:bta-miR-33a顯著降低了ELOVL6和HADHB的野生型載體雙熒光素酶活性,并顯著低于突變型及空載體組;而突變型組及空載體組之間的熒光值差異不顯著。結(jié)論:在奶牛乳腺上皮細胞中bta-miR-33a可以與ELOVL6、HADHB 3’UTR的靶位點-CAATGCA特異性結(jié)合,ELOVL6、HADHB基因的3’UTR區(qū)存在bta-miR-33a的靶位點。然后,將bta-miR-33a mimics、bta-miR-33a inhibitor及NC質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至奶牛乳腺上皮細胞,通過實時熒光定量驗證bta-miR-33a與ELOVL6、HADHB m RNA水平表達量的關系,并且利用western bolt對ELOVL6及HADHB蛋白水平檢測進一步驗證。結(jié)果:以轉(zhuǎn)染NC組為實驗對照,bta-miR-33a mimics組中bta-miR-33a的表達量明顯高于bta-miR-33a inhibitor組;而ELOVL6、HADHB的表達量在bta-miR-33a mimics組中顯著下降,在bta-miR-33a inhibitor組中表達量顯著升高。結(jié)論:在奶牛乳腺上皮細胞中bta-miR-33a下調(diào)ELOVL6、HADHB的表達,進一步驗證了ELOVL6、HADHB是bta-miR-33a的靶基因。最后,利用生物試驗方法進一步探究bta-miR-33a對奶牛乳腺上皮細胞中乳脂代謝相關基因的調(diào)控。一方面,細胞轉(zhuǎn)染后提取總RNA和總蛋白,檢測脂肪酸生物合成通路中與乳脂代謝相關基因CPTIA、SC4MOL,PTPLB,ALOX15的表達水平。結(jié)果:與NC組對比,轉(zhuǎn)染bta-miR-33a mimics組中CPTIA、SC4MOL,PTPLB的表達量低于bta-miR-33a inhibitor組,而ALOX15的表達量在bta-miR-33a mimics組中顯著高于bta-miR-33a inhibitor組。利用Western bolt對基因ALOX15蛋白水平檢測進一步驗證得到,在bta-miR-33a mimics組中ALOX15表達量顯著增加,在bta-miR-33a inhibitor組中ALOX15表達量顯著降低。另一方面,在細胞中通過檢測甘油三酯含量的變化可以衡量乳脂代謝的變化。將bta-miR-33a mimics、bta-miR-33a inhibitor及NC質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至奶牛乳腺上皮細胞,收集細胞,通過試劑盒檢測細胞內(nèi)甘油三酯的變化。結(jié)果:與轉(zhuǎn)染NC組對照,轉(zhuǎn)染bta-miR-33a mimics組中,bta-miR-33a的過表達促進了甘油三酯的合成,而bta-miR-33a inhibitor組內(nèi)甘油三酯的合成顯著降低。結(jié)論:bta-miR-33a可作為探討奶牛乳腺調(diào)控機制的miRNA。
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【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S823

【參考文獻】

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本文編號：1613296