本文關(guān)鍵詞： 水稻 水稻黑條矮縮病毒 灰飛虱 RNAi 轉(zhuǎn)基因株系　出處：《湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：水稻黑條矮縮病是由水稻黑條矮縮病毒(Rice black streaked dwarf virus, RBSDV)引起的水稻病毒病,嚴(yán)重危害水稻安全生產(chǎn)。本研究利用RNAi (RNA interference)技術(shù),構(gòu)建針對RBSDV病毒本身及其傳播媒介灰飛虱的RNAi載體,轉(zhuǎn)化RBSDV水稻高感品種武陵粳1號,以期獲得抗水稻黑條矮縮病和灰飛虱的水稻新種質(zhì),并探討抗水稻黑條矮縮病機(jī)制。結(jié)果如下：1.以RBSDV的S4、S8和S9序列為候選基因片斷,利用兩步法(pENTR-pANDA)快速高效構(gòu)建了5個RNAi載體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化武陵粳1號并獲得轉(zhuǎn)基因T1代陽性植株,其中含有S9干擾片段的轉(zhuǎn)基因植株]0株,S8轉(zhuǎn)基因13株,目前S4仍在轉(zhuǎn)化過程中。同時,對含有S8干擾片段的轉(zhuǎn)基因T2代植株進(jìn)行溫室RBSDV接種,初步實驗結(jié)果表明,沉默S8的轉(zhuǎn)基因株系對RBSDV呈現(xiàn)一定抗性。2.利用基因序列拼接手段將RBSDV的S9片段分別與S4、S8進(jìn)行拼接,組合成較大的干擾片段S4＆S9(一個拼接組合)和S8S9(兩個拼接組合),共構(gòu)建3個RNAi拼接載體,分別轉(zhuǎn)化武陵粳1號,獲得了沉默S4S9和S8S9的轉(zhuǎn)基因T1代陽性植株分別有8株系和66株系。3.構(gòu)建了分別針對灰飛虱關(guān)鍵基因激活性蛋白激酶C受體(Receptor for activated protein kinase C, RACK)基因、60S核糖體蛋白L5 (60S ribosomal protein L5, RPL5)基因、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH3)基因、60S核糖體蛋白L7a (60S ribosomal protein L7a, RPL7a)基因、60S核糖體蛋白L8(60Sribosomal protein L8, RPL8)基因、線粒體NADH脫氫酶亞基4和5基因(NADH dehydrogenase subunit 4 and NADH dehydrogenase subunit 5, ND4 and ND5)和線粒體NADH脫氫酶亞基2基因(NADH dehydrogenase subunit 2, ND2),共計7個基因的14個RNAi載體,轉(zhuǎn)化武陵粳1號,獲得轉(zhuǎn)基因T1代陽性植株。4.利用灰飛虱傳毒,建立了室內(nèi)離體葉片RBSDV接種和活體植株RBSDV接種體系。
[Abstract]:Rice black stripe dwarf disease is caused by rice black stripe dwarf virus Rice black streaked dwarf virus (RBSDV), which seriously endangers the safe production of rice. In this study, a RNAi vector targeting RBSDV virus and its transmission vector was constructed by using the RNAi RNA interference technique. In order to obtain new rice germplasm resistant to rice black stripe dwarf disease and ash planthopper, and to explore the mechanism of resistance to black stripe dwarf disease of rice, the results are as follows: 1. Using the S4S8 and S9 sequences of RBSDV as candidate gene fragments, we transformed Wulingjing 1, a highly susceptible rice variety, into a new rice germplasm resistant to rice black stripe dwarf disease and ash planthopper. Five RNAi vectors were constructed rapidly and efficiently by two-step pENTR-pANDA.The transformation of Wulingjing 1 by Agrobacterium tumefaciens was carried out to obtain the transgenic T1 generation positive plants, including the transgenic plants containing S9 interference fragments. At present, S4 is still in the process of transformation. At the same time, transgenic plants containing S8 interference fragments were inoculated with RBSDV in greenhouse. The transgenic lines silencing S8 showed resistance to RBSDV. The S9 fragment of RBSDV was spliced with S4 S8 by gene sequence splicing. S4 & S9 (a splicing combination) and S8S9 (two splicing combinations) were combined to construct three RNAi splicing vectors, which were transformed into Wulingjing 1, respectively. Eight lines and 66 lines of transgenic T1 generation positive plants with silencing S4S9 and S8S9 were obtained respectively. The gene of 60S ribosomal protein L560S ribosomal protein L5 (RPL5) was constructed for the key gene activated protein kinase C receptor (Receptor for activated protein kinase C, RPL5) of planthopper, respectively. Glyceral dehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH3) gene of 60S ribosomal protein L7a, RPL7a) gene of 60S ribosomal protein L8 (RPL8). Mitochondrial NADH dehydrogenase subunits 4 and 5, nadh dehydrogenase subunit 4 and NADH dehydrogenase subunit 5, ND4 and ND5) and mitochondrial NADH dehydrogenase subunit 2, nadh dehydrogenase subunit 2, ND2, were transformed into Wulingjing 1 by 14 RNAi vectors of 7 genes. Transgenic T1 generation positive plants. 4. The indoor RBSDV inoculation system in vitro and RBSDV inoculation system in living plantlets were established by using planthopper transfered virus.
【學(xué)位授予單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S435.111.4

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本文編號：1508042