本文關(guān)鍵詞： 鐵皮石斛 Illumina HiSeq高通量測序 生物學(xué)特性 GC/MS iTRAQ　出處：《廣州中醫(yī)藥大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:鐵皮石斛(Dendrobium off icinal Kimura et Migo)為蘭科石斛屬多年生草本,具有益胃生津,滋陰清熱的功效。鐵皮石斛以新鮮或干燥的莖入藥,為藥食兩用的名貴中藥材,野生資源分布在廣東、福建、安徽、浙江、廣西、云南等地區(qū)的陰濕、溫暖的環(huán)境中。野生鐵皮石斛越來越少,隨需求量的不斷增大,鐵皮石斛人工栽培面積不斷擴(kuò)大,高度集約化的種植,加之通風(fēng)不暢,生長環(huán)境普遍高溫、高濕,成為多種有害病菌的溫床。近年來,人工種植鐵皮石斛病害有逐年加重的趨勢,且不易治理,損失較大。目前除了大量噴灑化學(xué)藥物,尚無高效的防治辦法,病害防治成為鐵皮石斛種植產(chǎn)業(yè)中關(guān)鍵的一環(huán),若要高效快速防治病害的發(fā)生必須先了解其病原物,才能提出相應(yīng)的高效易行的防治措施。因此,本研究綜合形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀、IlluminaHiSeq高通量測序及生物信息學(xué)分析確定鐵皮石斛病原物種,并系統(tǒng)研究其物種的生物學(xué)特性,為病害防治提供依據(jù);同時深入研究鐵皮石斛感染炭疽病后的代謝組學(xué)與蛋白組學(xué),探討與病害相關(guān)的代謝物、蛋白質(zhì)及其可能的作用機(jī)理,為鐵皮石斛抗病品種創(chuàng)制或選育提供理論支持。方法:本研究通過建立鐵皮石斛病原菌分離鑒定體系,并系統(tǒng)研究鐵皮石斛炭疽病病原的生物學(xué)特性,感染炭疽病后的代謝組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué),探討有關(guān)病程的代謝物、蛋白質(zhì)及其分子機(jī)制。具體工作包括:1.鐵皮石斛病原菌分離鑒定體系的建立:從鐵皮石斛炭疽病葉中分離純化的菌株,經(jīng)致病性測定表明為鐵皮石斛病原菌,采用觀察病害癥狀、培養(yǎng)性狀、形態(tài)學(xué)特征、Illumina HiSeq高通量測序及生物信息學(xué)分析手段確定病原菌物種;2.根據(jù)鐵皮石斛病樣分離純化鑒定的結(jié)果,選炭疽菌的代表性菌株,研究不同因素對其生物學(xué)特性的影響;3.采集經(jīng)膠孢炭疽菌處理的感病鐵皮石斛葉片,經(jīng)樣本前處理、GC/MS分析、生物信息學(xué)分析等找出差異代謝物,初步探討參與病害的差異代謝物及代謝通路分析;4.采集經(jīng)膠孢炭疽菌處理后鐵皮石斛感病葉片,經(jīng)樣品制備、蛋白定量、SDS-PAGE電泳樣品的檢測、蛋白還原烷基化及酶解、反相色譜分離、蛋白鑒定、生物信息學(xué)分析等找出差異蛋白質(zhì),初步探討參與病害過程的蛋白質(zhì)及其作用機(jī)理。結(jié)果:1.鐵皮石斛病原菌分離鑒定體系的建立:綜合鐵皮石斛病原真菌的培養(yǎng)性狀、形態(tài)學(xué)特征、致病性測定、Illumina HiSeq高通量測序分析及全基因組進(jìn)化樹將各代表菌株分別鑒定為白紋羽病菌或褐座堅(jiān)殼菌(Rosellinia necatrix)、R.necatrix、膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、Diaporthe ampelina、Podospora anserina、圍小叢殼菌(Glomerella cingulata)、菜豆殼球孢(Macrophominaphaseolina)、D.ampelina。DFW07-B菌株未能確定物種,但是否為新物種尚不能確定,有待進(jìn)一步的研究。其中,白紋羽病菌或褐座堅(jiān)殼菌(R.necatrix)、D.ampelina、P.anserina、圍小叢殼菌(G.cingulata)、菜豆殼球孢(M.phaseolina)為鐵皮石斛病原真菌的新紀(jì)錄種。2.鐵皮石斛病原菌生物學(xué)特性分析:鐵皮石斛膠孢炭疽菌在PDA、PSA培養(yǎng)基上較適宜菌絲生長并促進(jìn)分生孢子的產(chǎn)生;菌絲在10～35℃下均可生長,20～30℃下菌絲濃密且生長速度快,20℃時最利于產(chǎn)生分生孢子;pH 5～12條件下菌絲均可以生長,最適宜產(chǎn)生分生孢子的pH為7;菌絲在光照條件下生長速度快,黑暗下益于產(chǎn)生孢子;以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基宜于菌絲生長,可溶性淀粉最益于產(chǎn)生分生孢子;蛋白胨是最利于菌絲濃密生長及產(chǎn)生分生孢子的氮源;菌絲與分生孢子的致死溫度均為55℃。鐵皮石斛圍小叢殼菌在PDA上較適宜生長;28℃時菌絲最濃密、生長最快,子囊殼產(chǎn)量也最高;光照可促進(jìn)子囊殼的產(chǎn)生;pH 8時菌絲生長最快,pH 9時子囊殼產(chǎn)量最高;山梨醇對菌絲的生長最有利,在麥芽糖碳源上菌絲濃密,子囊殼的產(chǎn)量達(dá)到最高;菌絲對蛋白胨氮源的利用率最高。菌絲體的水浴致死條件是50℃。3.鐵皮石斛與膠孢炭疽病互作代謝組學(xué)分析:成功建立了各分析組的多維統(tǒng)計(jì)分析模型,并結(jié)合單維統(tǒng)計(jì)分析,從鑒定出的305個代謝物共篩選出84個差異代謝產(chǎn)物。感病材料含有除亞氨基二乙酸(iminodiacetic acid)外的83種差異代謝物,且其中的36種為感病組特有的代謝物,其余的47種代謝物中絕大多數(shù)在感病材料中的含量呈不同程度的上升趨勢,而下調(diào)的僅有4種�？赡芘c病程相關(guān)的代謝物有海因、亞精胺、熊果苷、海藻糖-6-磷酸、馬尿酸、兒茶酚、草酸等,其中酒石酸、丙二酸、兒茶酚有加重鐵皮石斛病情的趨勢,有待進(jìn)一步分析研究。4.鐵皮石斛與膠孢炭疽病互作的蛋白質(zhì)組學(xué)分析:成功建立了 iTRAQ技術(shù)分析鐵皮石斛感病組-正常組蛋白組學(xué)體系,共鑒定3956個蛋白,可信蛋白數(shù)為2246個,篩選出133個感病組-正常組差異表達(dá)蛋白,其中表達(dá)上調(diào)蛋白67個,而表達(dá)下調(diào)蛋白有66個。GO功能分類及其富集表明這些差異蛋白主要參與轉(zhuǎn)運(yùn)活性、催化活性和酶調(diào)控活性,KEGG通路顯著性富集于代謝途徑、次生代謝產(chǎn)物生物合成、碳代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工、乙醛酸鹽代謝、光合作用、光合生物中的碳固定等。并找出與病程相關(guān)的熱休克蛋白70、蔗糖合酶、抗真菌蛋白、葉綠素a/b結(jié)合蛋白等,為蛋白水平研究鐵皮石斛病害及培育抗病品種提供依據(jù)。結(jié)論:以感病的鐵皮石斛葉片為試驗(yàn)材料,基于IlluminaHiSeq高通量測序技術(shù)建立了鐵皮石斛病原菌分離鑒定體系,鑒定出6種病原真菌,其中5種為鐵皮石斛病原菌新紀(jì)錄種。本研究首次對鐵皮石斛病原真菌基因組進(jìn)行了分析,為鐵皮石斛病害防治的生物學(xué)研究提供寶貴的基因組數(shù)據(jù)。對鐵皮石斛炭疽菌進(jìn)行了較為全面的生物學(xué)特性研究,為鐵皮石斛炭疽病害的防治提供參考。分別基于GC/MS、iTRAQ技術(shù)對不同處理組(感病組與正常組)的鐵皮石斛葉片樣本進(jìn)行了代謝組學(xué)、蛋白組學(xué)分析,并找出與病害相關(guān)的代謝物與蛋白質(zhì),為分子水平研究鐵皮石斛病害及培育抗病品種奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S435.672

【參考文獻(xiàn)】

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