本文關鍵詞： 玉米大斑病菌 生物信息學 實時熒光定量PCR SNF1蛋白激酶 基因敲除　出處：《沈陽農(nóng)業(yè)大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：玉米大斑病(Northern Leaf Blight Corn)是全世界玉米產(chǎn)區(qū)的主要葉部病害之一,是由大斑凸臍蠕孢菌[Exserohilum turcicum(Pass.)LeonardSuggs](無性態(tài))侵染引起的,該病害在我國東北、華北北部、西北和南方山區(qū)冷量玉米產(chǎn)區(qū)發(fā)病較為嚴重。玉米大斑病流行可使玉米減產(chǎn)20～30%,給玉米生產(chǎn)帶來嚴重威脅。目前關于玉米大斑病菌[SeSosphaeria turcia(Luttrell)LeonardSuggs](有性態(tài))致病因子的研究主要集中在細胞信號傳導途徑類、細胞壁降解酶類、氧化還原酶類、黑色素類以及毒素等方面。研究較為深入的一類為細胞信號傳導途徑包括:cAMP途徑、MAPK途徑、Ca2+途徑等,但對AMPK途徑的相關研究較少。SNF1蛋白激酶是AMPK在植物病原真菌中的同源蛋白,所以本文以SNF1基因為切入點,克隆玉米大斑病菌中StSNF1基因,利用生物信息學技術分析該基因編碼蛋白的理化性質(zhì)及結構特征,并利用實時熒光定量PCR技術監(jiān)測玉米大斑病菌侵染寄主各個時期、分生孢子萌發(fā)侵染過程中以及不同碳源培養(yǎng)下StSNF1基因的表達情況,構建SrSNF1基因敲除載體并成功獲得1個StSNF1基因突變體,研究結果總結如下:1.通過使用NCBI、JGI數(shù)據(jù)庫的BLAST功能,明確SNF1基因在玉米大斑病菌基因組中的位置;利用玉米大斑病菌基因組數(shù)據(jù)庫信息設計特異性引物SNF1F1和SNF1 R1,擴增出玉米大斑病菌SNF1基因;同源性分析表明,該基因在玉米大斑病菌中為單拷貝,將其命名為StSNF1;序列分析表明,該基因全長為3046 bp,由2個內(nèi)含子與3個外顯子組成,開放閱讀框為 2634bp,編碼 877個氨基酸,與玉米圓斑病菌(Cochliobolus carbonum)CcSNF1基因的結構高度相似。2.通過生物信息學分析技術對StSNF1基因編碼的StSNF1蛋白進行分析。結果表明,該蛋白由877個氨基酸組成,分子量為97.94 kD,pI值為8.29,不穩(wěn)定系數(shù)為53.24,總平均疏水性指數(shù)(GRAVY)為-0.638,為親水性蛋白;在編碼該蛋白的氨基酸序列中未檢測到跨膜結構域以及信號肽的存在,推測StSNF1不屬于膜蛋白或分泌蛋白;亞細胞定位結果表明,該蛋白在細胞核內(nèi)的K-NN百分率為78.3%,推測該蛋白行使功能的主要場所為細胞核;在功能域方面,StSNF1包括1個N端域和1個C端域,N端域含有1個蛋白激酶結構域以及1個碳代謝產(chǎn)物去阻遏蛋白激酶泛素相關結構域(SNF1_UBA),C端則為5個激酶相關結構域1(KA1)的串聯(lián)組合;二級結構分析表明,無規(guī)則卷曲的含量最多,其次為α-螺旋;同源性分析表明,該蛋白與玉米圓斑病菌的CcSNF1蛋白有較高同源性,一致性為90.92%,與釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)以及其他病原真菌的同源性較低。3.通過實時熒光PCR技術研究玉米大斑病菌StSNF1基因的表達情況。結果表明,該基因在接種玉米后72h表達量達到最大,96h表達下調(diào),120h又呈現(xiàn)上調(diào)趨勢;在分生孢子萌發(fā)侵染過程中StSNF1的表達量逐步上調(diào),24 h時(侵入絲形成時期)達到最大,為6 h時(附著胞形成初期)表達量的4倍,由此可以推測StSNF1與分生孢子萌發(fā)侵染有關;StSNF1基因在蔗糖培養(yǎng)基中的表達量最高,果膠培養(yǎng)基次之,在甘油培養(yǎng)基中的表達量最低,在葡萄糖和果糖培養(yǎng)基中的表達量趨于一致,分別是蔗糖與果膠培養(yǎng)基中表達量的1/3和1/2,由此可以確定StSNF1基因與蔗糖和果膠的利用有關。綜上所述,StSNF1基因在侵染后期大量表達,在分生孢子萌發(fā)侵染過程中表達呈上調(diào)趨勢,同時與碳源利用密切相關。4.通過對玉米大斑病菌遺傳轉化體系的優(yōu)化,成功獲得1個StSNF1基因突變體。研究發(fā)現(xiàn),使用溶壁酶、崩潰酶、蝸牛酶混合酶解玉米大斑病菌孢子釋放原生質(zhì)體的最適溫度為28℃,最適酶解時長為6～8小時,在此條件下原生質(zhì)體的釋放量最大。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S435.13
，

本文編號：1475898