本文關鍵詞： 奶牛 脂肪肝 iTRAQ蛋白質組學 GC/MS代謝組學 差異蛋白 差異代謝物　出處：《黑龍江八一農墾大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：圍產期奶牛常處于能量負平衡(NEB)和免疫抑制狀態(tài),NEB期間體脂動員釋放出大量非酯化脂肪酸(NEFA),肝臟吸收NEFA導致肝臟中脂蛋白代謝的損傷,大量甘油三酯蓄積在肝臟內。極低密度脂蛋白(VLDL)是反芻動物肝臟清除甘油三酯的主要形式,磷脂、膽固醇脂以及甘油三脂是合成VLDL的主要成分,而膽堿是肝臟合成磷脂的重要前體物質。目前,在奶牛營養(yǎng)管理中常補充過瘤胃膽堿以改善圍產期奶牛的肝臟脂質代謝和免疫功能。然而添加膽堿可影響肝脂代謝中哪些通路,目前尚不明確。據(jù)此,本項目用NEFA模擬能量負平衡環(huán)境建立犢牛肝細胞的脂肪沉積模型,在添加氯化膽堿的基礎上,利用iTRAQ技術和GC/MS對牛肝細胞脂質代謝特征進行系統(tǒng)全面分析,闡明膽堿對能量負平衡所致的肝脂沉積的主要代謝的調節(jié)作用,為今后奶牛脂肪肝的防治奠定基礎。本實驗采用兩步膠原酶灌流法對犢牛肝細胞進行分離培養(yǎng),細胞正常培養(yǎng)48 h后,饑餓培養(yǎng)6 h觀察細胞狀態(tài)良好,繼續(xù)后續(xù)實驗。1)采用時間梯度及密度梯度法,通過評價TG、TC、GLU、AST、GLO和NEFA等肝脂沉積敏感指標,確定NEFA誘導細胞最佳時間、氯化膽堿添加的最佳濃度及氯化膽堿添加的最佳時間。2)在確立NEFA誘導肝細胞脂肪沉積的時間及氯化膽堿添加的濃度及時間后,應用iTRAQ技術檢測兩組(NEFA vs.Con、N+CHO vs.NEFA)犢牛肝細胞樣品,獲得兩組間的差異蛋白,再進行GO和KEGG分析,確定差異蛋白的代謝通路。3)應用GC/MS技術檢測兩組(NEFA vs.Con、N+CHO vs.NEFA)犢牛肝細胞樣品,獲得兩組間的差異代謝物,再進行差異代謝物的生物信息學分析,確定差異代謝物參與的代謝通路。結果顯示:1)NEFA誘導肝細胞12 h與6 h和空白對照組相比細胞TG、TC和NEFA水平較高,說明細胞處于肝脂沉積狀態(tài),且12 h為最佳時間;通過對NEFA誘導的肝細胞中添加不同濃度的氯化膽堿孵育的肝細胞的結果顯示細胞TG、TC、NEFA和GLO的水平有所下調,說明膽堿對NEFA誘導的肝脂沉積癥狀有所緩解,且10μm/dl膽堿孵育6 h效果最佳。2)通過iTRAQ檢測和GO分析,NEFA vs.Con組共檢測出143個差異蛋白,其中下調蛋白有88個,有L-乳酸脫氫酶A鏈、山梨醇脫氫酶、果糖-二磷酸醛縮酶、磷脂轉運ATP酶、氧固醇結合蛋白和己糖激酶等。上調蛋白有55個,有肌動蛋白、脂肪酸結合蛋白、組蛋白、β-酪蛋白、精氨酸酶和線粒體丙酮酸載體等。篩選出的差異蛋白主要參與類固醇激素生物合成、糖酵解/糖異生、氨基酸的生物合成、RNA轉運和碳代謝等代謝通路;N+CHO vs.NEFA組共檢測出74個差異蛋白,其中下調蛋白有30個,有線粒體丙酮酸載體、線粒體輸入內膜轉位子亞基和跨膜蛋白等。上調蛋白有44個,有異檸檬酸脫氫酶、脂滴包被蛋白、肉堿O-棕櫚酰轉移酶1、載脂蛋白C-III和氧化低密度脂蛋白受體等。篩選出的差異蛋白主要參與PPAR信號通路、RNA轉運和剪接體等代謝通路。3)通過GC/MS檢測和多元統(tǒng)計分析,Con vs.NEFA組共檢測出21個差異代謝物。其中下調代謝物有8個,有乳糖酸、O-磷酸乙醇胺、亞油酸、月桂酸、β-甘露糖基甘油酸酯、20α-羥基膽固醇、洋地黃毒糖、6-氨基青霉烷酸。上調代謝物有13個,有腺嘌呤、α-色氨酸、琥珀酸、十七烷酸、2-羥基吡啶、乙醇酸、十五烷酸、葡萄糖酸、丙二酰胺等。其差異代謝物主要參與亞油酸代謝、類固醇激素生物合成等代謝通路;NEFA vs.N+CHO組中共檢測出14個差異代謝物,其中下調代謝物有4個,有3-羥基丙酸、磷霉素、膽甾烷-3,5,6-三醇、蘇糖酸。上調代謝物有10個,有乳糖酸、硬脂酸、腺嘌呤、花生四烯酸、2-甘油-棕櫚酸酯、丙二酰胺、β-甘露糖基甘油酸酯、水楊酸、胸苷和瓜氨酸。其差異代謝物主要參與不飽和脂肪酸的生物合成和花生四烯酸代謝等代謝通路。結論:本研究首次應用iTRAQ蛋白質組學和GC/MS代謝組學技術,結合多元統(tǒng)計分析和生物信息學技術,獲得了NEFA vs.Con組和NEFA vs.N+CHO組差異蛋白和差異代謝物,揭示了NEFA誘導的肝細胞脂質沉積的組學機制和膽堿對肝細胞脂類沉積中差異蛋白和代謝物的調控作用,為今后深入探索奶牛脂肪肝發(fā)病機理奠定了基礎。
[Abstract]:In this experiment , we used the technique of iTRAQ and GC / MS to study the lipid metabolism and immune function of bovine hepatocytes . The levels of TG , TC , NEFA and GLO in NEFA - induced liver cells were downregulated . The metabolites of NEFA vs . Con and NEFA vs . N + CHO were mainly involved in the biosynthesis of unsaturated fatty acids and metabolic pathways of arachidonic acid .

【學位授予單位】：黑龍江八一農墾大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S823

【參考文獻】

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1 何劍斌,田文儒,胡春山,范友勝,王洪誠,王廣君;應用血中生化指標監(jiān)測圍產期奶牛脂肪肝[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);1997年06期

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本文編號：1448064