本文關鍵詞： 蠟蚧輪枝菌 熱激蛋白 高溫脅迫 敲除菌株　出處：《沈陽農業(yè)大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：蠟蟻輪枝菌(Verticillium lecanii是一種可用于防治植物病蟲害的昆蟲病原真菌,生防真菌制劑貯存過程和田間殺蟲效果的穩(wěn)定性是影響其應用推廣的重要原因,溫度是影響真菌孢子的貯存和田間侵染力的重要因子,熱激蛋白對生物體耐熱性能的提高發(fā)揮著重要作用,因此,研究熱激蛋白對昆蟲病原真菌的耐熱性能的影響,對于解決真菌制劑的開發(fā)研制和田間應用推廣等問題有重要作用。本試驗以蠟蚧輪枝菌VL17、VL18菌株為供試菌株,比較了溫度對兩菌株的殺蚜活性、菌絲生長以及孢子萌發(fā)的差異,進而比較耐熱菌株和敏感菌株高溫脅迫下熱激蛋白基因表達的差異,找出耐熱蠟蟻輪枝菌在高溫脅迫時發(fā)揮主要作用的關鍵熱激蛋白種類,克隆關鍵熱激蛋白基因,并構建關鍵熱激蛋白基因敲除菌株,比較原始菌株和敲除菌株的生物學特性。本試驗揭示了熱激蛋白在蠟蚧輪枝菌中抗高溫脅迫的功能,為蠟蚧輪枝菌制劑的推廣和田間應用奠定理論基礎。研究結果如下:34! 下VL17、VL18菌株菌落直徑差異最顯著,VL18菌株比VL17大63.16%,37℃培養(yǎng)條件下,兩菌株均停止生長。37℃時對兩菌株孢子萌發(fā)的抑制作用最大,VL18菌株的孢子萌發(fā)率是VL17菌株的2.03倍。溫度影響蠟蚧輪枝菌對蚜蟲的致病力,28℃時兩菌株對蚜蟲的致病力最大,VL18菌株的蚜蟲校正死亡率是VL17菌株的1.02倍,37℃時兩菌株對蚜蟲的致病力最小,VL18菌株的蚜蟲校正死亡率是VL17菌株的2.67倍。通過溫度對蠟蚧輪枝菌的殺蚜活性、菌絲生長以及孢子萌發(fā)的研究,結果表明:蠟蟻輪枝菌VL18菌株比VL17更具有耐高溫脅迫的能力。蠟蚧輪枝菌 VL17、VL18 菌株經(jīng) 42℃高溫脅迫 15 min、30 min、60 min、120 min后,蠟蚧輪枝菌VL17菌株在脅迫15-60min范圍內,HSP70和SHSP基因的相對表達量均隨脅迫時間的增多而升高,60 min時SHSP基因表達量是HSP70的7.95倍,當脅迫時間達到120 min時,兩基因表達量均比60 min時降低,SHSP表達量是HSP70的4倍;耐熱菌株VL18菌株在脅迫30 min以上時,脅迫時間越長,HSP70和SHSP基因的相對表達量越大,脅迫30 min時,SHSP的表達量是HSP70的5.85倍,當脅迫時間達到120 min時,兩基因表達量差異最大,SHSP表達量是HSP70的6.41倍,表明SHSP基因對蠟蚧輪枝菌抗高溫脅迫具有更關鍵的作用,是蠟蚧輪枝菌耐熱的關鍵熱激蛋白基因。通過克隆SHSP基因,將基因組DNA序列與轉錄組序列比對,發(fā)現(xiàn)SHSP基因不含內含子。通過構建敲除載體pCAMBIA-barl-hsp,利用農桿菌介導的遺傳轉化法,獲得了SHSP基因的敲除菌株,PCR篩選鑒定,最終得到蠟蚧輪枝菌的敲除株。對原始菌株和敲除菌株的生物學特性進行比較,發(fā)現(xiàn)在相同碳源培養(yǎng)基上,敲除菌株菌落直徑比原始菌株小,在相同氮源培養(yǎng)基上,也是如此。敲除菌株的菌絲生長抑制率大于化學脅迫劑相同時的原始菌株菌絲生長抑制率,敲除菌株的孢子萌發(fā)率比化學脅迫劑相同時的原始菌株孢子萌發(fā)率小,說明敲除菌株對化學脅迫劑更敏感。在45℃高溫脅迫下,隨著脅迫時間的增長,蠟蚧輪枝菌原始菌株VL18菌株和敲除菌株的孢子萌發(fā)率均逐漸減小,在脅迫時間相同的情況下,敲除菌株的孢子萌發(fā)率比原始菌株的孢子萌發(fā)率小,當脅迫時間達到120min時,原始菌株的孢子萌發(fā)率是敲除菌株的3.52倍。在紫外線輻射下,隨著輻射時間的增長,蠟蚧輪枝菌原始菌株VL18菌株和敲除菌株的孢子萌發(fā)率均逐漸減小,且輻射時間相同時,敲除菌株的孢子萌發(fā)率比原始菌株小,當脅迫時達到10 min時,原始菌株與敲除菌株孢子萌發(fā)率差異最大,原始菌株是敲除菌株的2.83倍。在天數(shù)相同的情況下,敲除菌株對蚜蟲的致病力比原始菌株弱,到第5天時,原始菌株的蚜蟲校正死亡率比敲除菌株大7.53%。通過對原始菌株和敲除菌株的生物學特性比較,發(fā)現(xiàn)SHSP基因的缺失導致蠟蚧輪枝菌對碳氮源的利用率降低,對化學脅迫劑的抗性降低,對孢子耐高溫、耐紫外輻射的能力降低及對蚜蟲的致病力降低。
[Abstract]:Verticillium lecanii (Verticillium lecanii is used to control plant diseases and insect pests of entomopathogenic fungi, fungal biocontrol agents during storage and field insecticidal effect stability is an important reason for the effect of its application, the temperature affects the fungal spore storage and field infection force important factor, heat shock protein of organisms improvement of thermal resistance plays an important role, therefore, the research of heat shock proteins of entomopathogenic fungi resistance effect, to solve the fungal agent development and field application problems has an important role. In this experiment, Verticillium lecanii VL17 strain VL18 as tested strains, the temperature of two strains of aphid killing activity, mycelial growth and spore germination of the differences, and then compare the resistant and sensitive strains under high temperature stress, heat shock protein gene expression, find out the heat resisting Verticillium lecanii The key of heat shock protein species play a major role in high temperature stress, heat shock protein gene cloning of key, and the key to construct a heat shock protein gene knockout strains, compared to the original strain and knockout strains. The biological characteristics of this experiment reveals the heat shock protein in Verticillium lecanii in high temperature stress, which the theoretical basis for the preparation of leacanii promotion and field application. The results are as follows: 34! VL17, the most significant strain VL18 colony diameter difference, strain VL18 is 63.16% more than VL17, 37 C conditions, two strains were.37 degrees to stop the growth inhibition of two strains of spore germination, VL18 strains of spore germination rate is 2.03 times higher than the VL17 strain. The pathogenicity of temperature effect of Verticillium lecanii on aphids, the maximum 28 degrees on the pathogenicity of two strains of aphids, VL18 strains of aphids corrected mortality is 1.02 times that of VL17 strains, 37 C two The pathogenicity of aphids was minimal, VL18 strains of aphids corrected mortality is 2.67 times that of VL17 strain. The temperature of Verticillium lecanii activity, mycelial growth and spore germination of the study, the results show that the Verticillium lecanii VL18 strain has more tolerance to heat stress than VL17 wax. Lecanicillium VL17, VL18 strain was 42 degrees high temperature stress of 15 min, 30 min, 60 min, 120 min, Verticillium lecanii VL17 strain stress in the range of 15-60min, the relative expression of HSP70 and SHSP genes were increased with the stress time increasing, the 60 min SHSP gene expression is 7.95 times of HSP70, when the stress time reaches 120 min, two gene expression were higher than 60 min decreased, the expression of SHSP is 4 times that of HSP70 VL18 strain; heat stress in the above 30 min, the stress time was longer, the relative expression of HSP70 and SHSP genes and the larger the amount of stress of 30 min SHSP. The expression is 5.85 times that of HSP70, when the stress time reaches 120 min, the two biggest differences in gene expression, the expression of SHSP is 6.41 times that of HSP70, suggesting that the SHSP gene of Verticillium lecanii against high temperature stress has a key role, is the key of heat shock protein leacanii due to heat through the cloning of SHSP gene, the genomic DNA sequence and transcriptome sequence alignment revealed that SHSP gene contains no intron. Through the construction of knockout vector pCAMBIA-barl-hsp by Agrobacterium mediated transformation, the SHSP gene knockout strains, screening and identification of PCR, finally get the leacanii knockout the original strains and strains. Knockout biological characteristics were compared, found in the same medium carbon source, knockout strains colony diameter than the original strain, under the same nitrogen source medium, too. Knockout strains of mycelial growth inhibition rate was higher than the chemical At the same time, the original stress agent phase mycelial growth inhibition rate, knockout germination rate than the chemical stress agent and original strain spore germination rate of small strain spores that knockout strains of chemical agent is more sensitive. Stress at 45 DEG C under high temperature stress, with the stress time increasing, the original strain of Verticillium lecanii VL18 knockout strains and germination rate decreased in spore strains, stress time under the same conditions, the germination rate of knockout germination rate is smaller than the original strain of spore spore strains, when the stress time reaches 120min, the original strain of spore germination rate is 3.52 times the knockout strain. In the ultraviolet radiation. Along with the radiation time the growth of Verticillium lecanii VL18 strain and original strain knockout strains decreased the germination rate of spores, and radiation at the same time, knockout strains of spore germination than the original strain, when the stress reaches 10 Min, the original strain and knockout strains of spore germination rate difference is 2.83 times of the original strain knockout strains. In the days under the same knockout pathogenicity on aphid strain than the original strain is weak, the fifth day, the mortality rate than the original strain of aphid knockout strains based on 7.53%. the original strain and biological characteristics of knockout strains, found that deletion of the SHSP gene caused by Verticillium lecanii on carbon and nitrogen source rate, reduce the resistance to chemical stress agent, high temperature resistance of spores, ultraviolet radiation and decrease on aphid virulence.

【學位授予單位】：沈陽農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S476.12

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 陳孝達;;介紹防治棗龜蠟蚧的特效藥——蠟蚧靈[J];陜西林業(yè)科技;1991年02期

2 盧義修,劉獻盼,高殿銀,郭友慶,王興錄,邊新倫,胡富香;蠟蚧靈防治棗龜甲蠟蚧試驗[J];河北果樹;1997年02期

3 劉春來,王克勤,李新民,劉新潤,閆明宇,周英偉;蠟蚧輪枝菌素對5種蚜蟲毒殺作用的初步研究[J];中國農學通報;2003年02期

4 武運霞;葡萄蠟蚧的防治[J];河北果樹;2003年06期

5 李鋒,殷華,蔣繼宏,張冬;蠟蚧輪枝菌毒素的抑菌與殺蟲活性[J];江蘇農業(yè)科學;2004年02期

6 殷華,李鋒,蔣繼宏;蠟蚧輪枝菌液體發(fā)酵的代謝動力學[J];安徽農業(yè)大學學報;2004年03期

7 周曉榕;高翔;王建國;王新樂;;營養(yǎng)和農藥對蠟蚧輪枝菌生長發(fā)育的影響[J];植物保護;2006年05期

8 徐士波;岳杰;鞠文鵬;常影;高飛;;白蠟蚧的防治技術[J];林業(yè)實用技術;2009年01期

9 田華;趙宏霞;王莉;;環(huán)境條件對蠟蚧輪枝菌生長的影響及發(fā)酵培養(yǎng)研究進展[J];河南農業(yè)科學;2010年09期

10 高英;薛皎亮;熊琦;毛立新;謝映平;;鄰苯二甲酸二丁酯——蠟蚧霉代謝產(chǎn)物[J];山西大學學報(自然科學版);2013年01期

相關會議論文 前10條

1 謝明;扈新萍;萬方浩;;蠟蚧輪枝菌應用研究新進展[A];第四屆全國綠色環(huán)保農藥新技術、新產(chǎn)品交流會暨第三屆生物農藥研討會論文集[C];2006年

2 閻峻;;生理生化方法在蠟蚧輪枝菌及一些相關菌聚類分析上的應用[A];中國蟲生真菌研究與應用[C];1991年

3 邱君志;黃天培;潘黎;關雄;;蠟蚧輪枝菌種內遺傳差異的研究[A];中國菌物學會第三屆會員代表大會暨全國第六屆菌物學學術討論會論文集[C];2003年

4 鄧春生;吳正鎧;葉正楚;;蠟蚧輪枝孢原生質體再生條件的研究[A];《中國蟲生真菌研究與應用》（第二卷）[C];1991年

5 李國霞;高希武;劉青春;嚴毓驊;;蠟蚧輪枝菌的發(fā)酵培養(yǎng)及其代謝產(chǎn)物對害蟲毒殺作用的研究[A];全國生物防治學術討論會論文摘要集[C];1995年

6 謝明;扈新萍;萬方浩;;國外蠟蚧輪枝菌應用研究進展[A];科技創(chuàng)新與綠色植保——中國植物保護學會2006學術年會論文集[C];2006年

7 謝明;吳暢;邱衛(wèi)亮;萬方浩;;若干殺蟲劑與除草劑對蠟蚧輪枝菌孢子萌發(fā)的影響[A];全國生物防治暨第八屆殺蟲微生物學術研討會論文摘要集[C];2000年

8 李加智;張春霞;李國華;;寄生于橡副珠蠟蚧上的川上座殼孢[A];中國熱帶作物學會2007年學術年會論文集[C];2007年

9 鄧春生;吳正鎧;葉正楚;;蠟蚧輪枝孢原生質體形成和再生的研究[A];《中國蟲生真菌研究與應用》（第二卷）[C];1991年

10 鄧春生;吳正鎧;葉正楚;;蠟蚧輪枝孢原生質體的形成、再生、誘變及其突變株對蚜蟲的毒力測定[A];全國生物防治學術討論會論文集[C];1991年

相關重要報紙文章 前1條

1 淮安生物工程高等職業(yè)學校 張盼;把握關鍵時期防治白蠟蚧[N];江蘇農業(yè)科技報;2014年

相關博士學位論文 前2條

1 林勇文;蘿卜蚜取食誘導擬南芥揮發(fā)性物質對蠟蚧輪枝菌的影響[D];福建農林大學;2017年

2 王聯(lián)德;蠟蚧輪枝菌毒素及其對煙粉虱種群控制作用的研究[D];福建農林大學;2003年

相關碩士學位論文 前10條

1 田慧霞;2種幾丁質酶基因超表達載體構建及對蠟蚧菌的轉化[D];西南大學;2015年

2 張瑩玲;蠟蚧霉的固體發(fā)酵動力學研究[D];山西大學;2014年

3 方大琳;蠟蚧輪枝菌抗逆菌株的篩選及其對扶桑綿粉蚧的毒力[D];福建農林大學;2015年

4 張曉林;外源表皮降解蛋白酶基因（Cdep1）轉化蠟蚧菌及其酶活性增強效果評價[D];中國農業(yè)科學院;2016年

5 戈婉兒;熱激蛋白對蠟蚧輪枝菌抗高溫脅迫的功能分析[D];沈陽農業(yè)大學;2017年

6 姜榮良;蠟蚧輪枝菌抗逆菌株的篩選及殺蟲活性的測定[D];福建農林大學;2010年

7 周潔;蠟蚧輪枝菌的土壤宿存動態(tài)及其基本碳氮營養(yǎng)需求特性分析[D];中國農業(yè)科學院;2013年

8 俞云峰;不同惰性載體上發(fā)酵產(chǎn)蠟蚧輪枝菌分生孢子生物特性的研究[D];浙江理工大學;2010年

9 翟曉曼;蠟蚧輪枝菌毒力改良及其效果評價[D];中國農業(yè)科學院;2012年

10 程聰;橡副珠蠟蚧幾種主要天敵昆蟲人工擴繁技術研究[D];海南大學;2013年

，

本文編號：1446710