本文關(guān)鍵詞： 黃曲霉毒素B1 巨噬細(xì)胞 自噬 ROS 胞外陷阱　出處：《吉林大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：細(xì)胞自噬(Autophagy)即真核細(xì)胞中進(jìn)化上高度保守、用于將細(xì)胞內(nèi)衰老、變性或受損的細(xì)胞器及蛋白質(zhì)運(yùn)送到溶酶體進(jìn)行消化并降解的過程。根據(jù)其降解底物及形成方式不同分為巨自噬,微自噬及分子伴侶自噬。它們在體內(nèi)的發(fā)生機(jī)制以及功能不盡相同。自噬的發(fā)生要受到自噬相關(guān)基因以及相關(guān)蛋白的調(diào)控,目前在酵母細(xì)胞中已有超過36個自噬相關(guān)基因(Autophagy-related gene,ATG)被發(fā)現(xiàn),且在哺乳動物細(xì)胞中大多數(shù)都存在其同源基因。自噬相關(guān)蛋白是由自噬基因編碼的,他們相互聯(lián)系構(gòu)成了自噬過程的核心分子機(jī)制,并參與了多種自噬過程的調(diào)控。近些年來,多種自噬相關(guān)通路已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。胞外陷阱(Extracelluar Traps,ETs)是由細(xì)胞核DNA構(gòu)成的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成,可以用來限制病原微生物的活動,并通過聚集在纖維網(wǎng)上的顆粒蛋白來殺滅病原微生物的一種新型細(xì)胞天然免疫機(jī)制。它是一種不同于凋亡和壞死新型的細(xì)胞死亡形式,是在免疫細(xì)胞中發(fā)生的一種獨(dú)特的抵抗感染和毒物入侵的的自我保護(hù)方式。目前發(fā)現(xiàn)能夠誘導(dǎo)ETs的微生物包括細(xì)菌、真菌和寄生蟲等,但真菌毒素是否能夠誘導(dǎo)該機(jī)制尚未見報道。黃曲霉毒素B1(Aflatoxin,AFB1)是目前發(fā)現(xiàn)的真菌類毒素中毒性最大、污染范圍最廣的毒素之一,微量AFB1能造成很大的傷害。關(guān)于AFB1在體內(nèi)的作用機(jī)制已經(jīng)成為國內(nèi)外熱點研究的問題。因此,本研究以巨噬細(xì)胞為模型細(xì)胞,考察AFB1是否能夠引起細(xì)胞自噬、ROS以及胞外陷阱產(chǎn)生,并在分子作用機(jī)制層面深入探討AFB1誘導(dǎo)的自噬、ROS和胞外陷阱之間的關(guān)系。首先,我們考察了AFB1對巨噬細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)情況。利用熒光顯微鏡對AFB1作用下的鼠源性巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞GFP-LC3以及ptf-LC3(GFP-LC3和RFP-LC3串聯(lián))的表達(dá)水平進(jìn)行觀察;利用western blot技術(shù)對RAW264.7細(xì)胞和人源性巨噬細(xì)胞THP-1細(xì)胞的自噬標(biāo)記蛋白LC3、P62以及自噬相關(guān)通路蛋白Beclin1、ERK、P-ERK、P-MEK的表達(dá)水平進(jìn)行檢測;并通過自噬抑制劑氯喹(CQ)觀察AFB1誘導(dǎo)的自噬是否為完全自噬,以及通過MEK抑制劑PD98059觀察Beclin1、MEK、ERK與自噬之間的關(guān)系。結(jié)果顯示,AFB1能夠誘導(dǎo)細(xì)胞中GFP-LC3斑點增多,能夠使LC3蛋白的表達(dá)水平增加,且P62蛋白因被降解的量增加從而表達(dá)水平顯著降低,說明AFB1能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬的發(fā)生;AFB1能夠誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ptf-LC3斑點的表達(dá)且RFP-LC3斑點顯著強(qiáng)于GFP-LC3,CQ能夠顯著抑制LC3的降解過程,說明AFB1誘導(dǎo)的自噬為完全自噬;AFB1能夠誘導(dǎo)Beclin1蛋白的表達(dá)以及MEK、ERK的磷酸化,且PD98059能夠抑制Beclin1、LC3蛋白的表達(dá)及MEK、ERK的磷酸化過程,說明AFB1誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞自噬是通過MEK、ERK的途徑實現(xiàn)的并與Beclin1相關(guān)。綜上所述,AFB1誘導(dǎo)了人源性和鼠源性巨噬細(xì)胞自噬,該自噬為完全自噬,由MEK、ERK通路介導(dǎo)并受Beclin1調(diào)節(jié)。其次,我們分析了AFB1誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞ROS和胞外陷阱產(chǎn)生的情況。我們利用熒光酶標(biāo)儀對經(jīng)AFB1作用的RAW264.7細(xì)胞和THP-1細(xì)胞的ROS以及胞外DNA的產(chǎn)量進(jìn)行了檢測;利用熒光顯微鏡對經(jīng)AFB1處理的THP-1細(xì)胞產(chǎn)生的胞外陷阱的結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察及其組分進(jìn)行了共定位。結(jié)果顯示,AFB1能夠誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞和THP-1細(xì)胞中ROS的產(chǎn)量呈時間及濃度依賴性增加并受NOX2抑制劑DPI抑制,且胞外DNA的表達(dá)水平呈濃度依賴性增加;胞外陷阱的形態(tài)隨濃度的增加而發(fā)生變化,組蛋白H3、彈力蛋白酶和髓過氧化物酶是巨噬細(xì)胞胞外陷阱的組成成分。綜上所述,這些結(jié)果表明AFB1誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞ROS的產(chǎn)生且具有NOX2依賴性,AFB1能夠誘導(dǎo)胞外陷阱的產(chǎn)生且其結(jié)構(gòu)與嗜中性粒細(xì)胞胞外陷阱(Neutrophil extracellular traps,NETs)相似,而組蛋白H3、髓過氧化物酶、彈力蛋白酶為胞外陷阱的主要組成成分。最后,我們在分子作用機(jī)制層面探究了AFB1誘導(dǎo)的自噬、ROS和胞外陷阱之間的關(guān)系。利用熒光顯微鏡對經(jīng)AFB1處理的THP-1細(xì)胞的胞外陷阱的產(chǎn)生進(jìn)行觀察,并用NOX2氧化酶抑制劑DPI、自噬抑制劑渥曼霉素研究ROS,自噬與胞外陷阱之間的關(guān)系;利用熒光酶標(biāo)儀對經(jīng)PMA作用的THP-1細(xì)胞ROS的產(chǎn)量進(jìn)行了檢測,研究ROS與胞外陷阱之間的關(guān)系;利用western blot技術(shù)檢測THP-1細(xì)胞的LC3的表達(dá)水平,并用NOX2氧化酶抑制劑DPI、自噬抑制劑渥曼霉素處理研究ROS與自噬之間的關(guān)系;最后用ELISA技術(shù)檢測巨噬細(xì)胞胞外陷阱對AFB1的降解水平。結(jié)果顯示,NOX2氧化酶抑制劑DPI以及自噬抑制劑渥曼霉素均抑制了細(xì)胞胞外陷阱的產(chǎn)生,說明胞外陷阱的形成依賴于NOX2產(chǎn)生的ROS以及自噬的發(fā)生;NOX2氧化酶抑制劑DPI能夠顯著地抑制細(xì)胞LC3的表達(dá)水平,說明AFB1誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞自噬受到ROS的調(diào)節(jié);AFB1在誘導(dǎo)胞外陷阱產(chǎn)生的同時本身也得到了顯著地降解。綜上所述,AFB1誘導(dǎo)NOX2依賴性的ROS的產(chǎn)生來誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞胞外陷阱的形成,ROS通過調(diào)節(jié)自噬從而調(diào)節(jié)胞外陷阱的產(chǎn)生,且巨噬細(xì)胞胞外陷阱的產(chǎn)生具有降解AFB1的作用�？傊�,本研究結(jié)果表明,AFB1能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7和THP-1發(fā)生完全自噬,且該自噬是通過激活MEK/ERK途徑以及上調(diào)Beclin1來實現(xiàn)的。AFB1通過誘導(dǎo)自噬以及NOX2依賴性的ROS的產(chǎn)生來誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7和THP-1胞外陷阱的形成。而且AFB1誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生在自噬發(fā)生的上游,對自噬具有調(diào)節(jié)作用。更重要的是,AFB1誘導(dǎo)胞外陷阱產(chǎn)生的同時本身也得到了顯著地降解。這些結(jié)果將為今后以自噬及胞外陷阱為靶標(biāo)開發(fā)新的抗AFB1的藥物提供新思路。
[Abstract]:Autophagy - related gene ( ATG ) has been found to be the core molecular mechanism of autophagy , which is different from apoptosis and necrosis . In conclusion , AFB1 was able to induce the production of ROS in RAW264.7 cells and THP - 1 cells and to be regulated by Beclin1 . The results showed that AFB1 could induce the production of ROS in RAW264.7 cells and THP - 1 cells . In conclusion , AFB1 can induce autophagy of macrophages RAW264.7 and THP - 1 . In conclusion , AFB1 can induce the formation of RAW264.7 and THP - 1 extracellular traps by activating MEK / ERK pathway and up - regulation Beclin1 .

【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S859.8

【參考文獻(xiàn)】

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