發(fā)布時間：2017-12-29 14:38

  本文關(guān)鍵詞：蘋果抗病相關(guān)基因CERK1克隆與功能分析　出處：《沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：蘋果是我國栽培面積較大的果樹之一,產(chǎn)量位于我國水果生產(chǎn)的首位,但蘋果病害的發(fā)生制約著我國果樹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。'寒富'蘋果是沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)育成優(yōu)質(zhì)的二倍體蘋果品種,但在生產(chǎn)過程中受真菌危害造成嚴(yán)重?fù)p失。課題組前期通過秋水仙素處理得到其同源四倍體植株,生根移栽后發(fā)現(xiàn),同源四倍體較二倍體植株對蘋果病害的抗性增強,同時觀察定植在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)科研基地的'嘎啦'蘋果,其同源四倍體同樣表現(xiàn)出較強的抗病性。多倍體育種是果樹的抗病育種途徑之一,多倍體果樹生長旺盛,適應(yīng)性強,抗逆性增加,目前研究廣泛的蘋果品種多為三倍體,四倍體較少,且主要集中于多倍體的生物學(xué)特性,果實性狀,耐寒性等。從果實抗病育種的需求出發(fā),開展同源四倍體蘋果抗病性的研究有著重要的意義。本研究首先對'寒富'和'嘎啦'蘋果及其同源四倍體葉片接種了炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides),用以評價蘋果二倍體與其同源多倍體抗病性差異。結(jié)合前期生物信息學(xué)分析結(jié)果和實時熒光定量PCR技術(shù),發(fā)現(xiàn)了與四倍體抗病性增加有關(guān)的CERK1基因表達量升高。利用PCR方法首次從'寒富'蘋果中分離得到了蘋果CERK1基因的cDNA全長序列,成功構(gòu)建了由35S啟動子驅(qū)動CERKl基因的過表達載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將過表達載體pOX-CERK1轉(zhuǎn)入蘋果和擬南芥中。最后對轉(zhuǎn)基因植株進行人工接種,明確了CERK 基因功能與植株抗病性關(guān)系。本文評價了蘋果二倍體及其同源四倍體抗病性差異,并且針對蘋果抗病相關(guān)基因CERK1功能進行了研究,對蘋果同源多倍化后植株抗病的分子機理和蘋果抗病育種研究具有重要意義,主要研究結(jié)果如下。1.采用人工接種的方法對'寒富'和'嘎啦'蘋果及其同源四倍體進行抗病性比較。觀察'寒富'和'嘎啦'蘋果及其同源四倍體葉片侵染炭疽病菌后發(fā)病情況,調(diào)查發(fā)病率和病情指數(shù)。結(jié)果表明,'寒富'和'嘎啦'蘋果有相似表現(xiàn),四倍體葉片發(fā)病程度較二倍體葉片輕,病情指數(shù)和發(fā)病率較低,結(jié)合分子生物學(xué)方法,運用實時熒光定量PCR技術(shù)對防御相關(guān)基因的表達進行分析,證明同源四倍體蘋果較其二倍體具有更優(yōu)良的抗病性能。2.通過'寒富'蘋果同源四倍體轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和實時熒光定量技術(shù)(qRT-PCR)確定受炭疽病菌誘導(dǎo)的抗病相關(guān)基因,克隆獲得了CERK1基因全長序列,cDNA全長1983bp。以pRI-101 AN為載體,將CERK1融合到pRI-101 AN上,構(gòu)建成蘋果CERK1基因過表達載體,命名為pOX-CERK1。3.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,將pOX-CERK1載體導(dǎo)入蘋果'GL-3'和擬南芥中。目前'GL-3'蘋果得到4個pOX-CERK1轉(zhuǎn)化株系。通過再生試驗,目的基因和NPTⅡ基因檢測說明蘋果CERK1基因已經(jīng)整合到'GL-3'蘋果中并得到超量表達。隨機挑選4個轉(zhuǎn)化獲得的擬南芥株系進行目的基因和NPTⅡ基因檢測,結(jié)果證明4個擬南芥株系均為pOX-CERK1轉(zhuǎn)化植株。4.采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進行蘋果CERK1基因同源表達和異源表達,人工接種方法驗證其功能。以同源表達蘋果CEPK1基因的蘋果'GL-3'組織培養(yǎng)苗葉片和異源表達蘋果CERK1基因的T2代擬南芥植株為試材,進行抗病性分析,人工接種后,蘋果和擬南芥轉(zhuǎn)化植株與對照相比發(fā)病程度降低,說明蘋果CERK1基因的過表達能夠增加植株抗病性。采用實時熒光定量PCR技術(shù),發(fā)現(xiàn)病原菌侵染后葉片中防御相關(guān)基因PR1、CDPK的表達量明顯升高,與前期結(jié)果相吻合,蘋果CERK1基因是抗病相關(guān)基因,蘋果同源加倍后抗性增強與其上調(diào)表達相關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S436.611

【參考文獻】

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