發(fā)布時間：2017-12-28 04:14

  本文關(guān)鍵詞：菜青蟲中腸響應(yīng)CoTI的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析　出處：《西南交通大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：菜青蟲(PierisrapaeL)屬鱗翅目粉蝶科昆蟲,是十字花科蔬菜的主要蟲害之一。菜青蟲利用消化道蛋白酶降解食物蛋白質(zhì)以獲得其生長發(fā)育必需的氨基酸,并利用細(xì)胞色素P450等解毒酶降解宿主植物來源的抗蟲次生代謝物。本研究前期研究結(jié)果表明,來自菜青蟲非宿主植物決明(Cassia obtusifolia)的胰蛋白酶抑制劑(CoTI)對菜青蟲有較強的抗性。本文利用分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)錄組測序等技術(shù)分析喂食CoTI前后,菜青蟲中腸消化酶等的轉(zhuǎn)錄水平變化,為研究CoTI的抗蟲機(jī)制打下基礎(chǔ)。本文首先將CoTI基因克隆到原核表達(dá)載體pET28a中,成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET28a/CoTI,經(jīng)PCR、雙酶切鑒定及測序分析,表明該重組質(zhì)粒含有目的基因片段,且構(gòu)建正確,表達(dá)純化蛋白并檢測濃度為920μg/ml。隨后對菜青蟲喂食含有CoTI的白菜葉,以喂食正常白菜葉的菜青蟲為對照,分別提取中腸總RNA,利用Illumina 4000測序平臺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。測序共獲得了菜青蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)17.16Gb,分別獲得28,918,396和28,678,331條高質(zhì)量的reads。通過Trinity軟件組裝共獲得51,544個Unigenes。將這些Unigenes序列與公共數(shù)據(jù)庫Nr、Swiss-Prot、GO、KOG、COG和KEGG等進(jìn)行比對注釋,,共有22,233條Unigenes獲得功能注釋。通過比對Nr數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)了相關(guān)的消化酶與解毒酶家族,105個絲氨酸蛋白酶(79個胰蛋白酶和26個糜蛋白酶,PrSPs),74個脂肪酶(PrLPs),17個淀粉酶(PrALs),113個細(xì)胞色素P450(PrCYP450s),46個羧酸酯酶(PrCXs),54個UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶(PrUGTs)和41個谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(PrGSTs)。比較對照組與實驗組菜青蟲中腸的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)有3,066個差異表達(dá)基因,并對它們進(jìn)行GO分析,COG分析與KEGG通路分析等。通過分析KEGG通路發(fā)現(xiàn),參與生長和發(fā)育信號通路的幾個關(guān)鍵基因wnt、Hippo和Notch在不同的處理條件下表達(dá)有所差異,這表明CoTI可能抑制了菜青蟲獲得正常的生長和發(fā)育的能力。對菜青蟲進(jìn)行qRT-PCR內(nèi)參基因選擇。先從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選8個比較穩(wěn)定的 Unigene,包括 Sec61、PSMD9、eIF2g、UPF3、LRE、NADH、hnRNP、THOC2作為候選內(nèi)參基因,然后選擇RPL32、EF1、GADPH等3個常用的內(nèi)參基因一起作為候選內(nèi)參基因,分析它們在菜青蟲不同組織,不同發(fā)育階段與不同脅迫條件下的相對表達(dá)水平。然后利用GeNorm與NormFinder軟件分析,發(fā)現(xiàn)UPF3的表達(dá)水平最為穩(wěn)定,因此選擇UPF3作為后續(xù)定量分析的內(nèi)參基因。
[Abstract]:Pieris rapae (PierisrapaeL) belongs to Lepidoptera Pieridae insects, is one of the main pests of cruciferous vegetables. The use of food protein degradation Pieris rapae and digestive protease to obtain the growth and development of essential amino acids, and the use of insect resistant secondary metabolites such as cytochrome P450 enzyme degradation of host plant sources. The preliminary study results show that the non host plants from Pieris rapae (Cassia obtusifolia) Cassia trypsin inhibitor (CoTI) has strong resistance against Pieris rapae. This paper analysis by molecular biology, transcriptome sequencing technologies such as feeding before and after CoTI, the changes of transcription level of caterpillar midgut digestive enzymes and lay the foundation for the study of the mechanism of CoTI resistance. Firstly, the CoTI gene was cloned into prokaryotic expression vector pET28a, the recombinant plasmid pET28a/CoTI by PCR, double enzyme digestion and DNA sequencing analysis showed that the recombinant plasmid containing the target gene fragment, and constructed correctly, protein expression and purification and detection of the concentration of 920 g /ml. Then the feed containing CoTI rapae cabbage leaves, cabbage leaves to feed normal caterpillar as control, were extracted from the midgut total RNA of transcriptome sequencing using Illumina 4000 sequencing platform. Sequencing transcriptome data were obtained Pieris 17.16Gb, obtained 28918396 and 28678331 high quality reads respectively. A total of 51544 Unigenes were assembled through the Trinity software assembly. These Unigenes sequences are annotated with the common database Nr, Swiss-Prot, GO, KOG, COG, and KEGG, and there are 22233 Unigenes to get the functional annotations. By comparing the Nr database found digestive enzymes and detoxification enzyme family related, 105 serine proteases (79 trypsin and chymotrypsin 26, PrSPs), 74 (PrLPs), 17 lipase amylase (PrALs), 113 cytochrome P450 (PrCYP450s), 46 carboxylic acid ester enzyme (PrCXs) 54, UDP- glycosyltransferase (PrUGTs) and 41 glutathione S- transferase (PrGSTs). The transcriptome data comparing the experimental group and the control group of Pieris rapae midgut, found 3066 differentially expressed genes, and their GO analysis, COG analysis and KEGG pathway analysis. Through the analysis of the KEGG pathway that participates in several key genes Wnt, growth and development of the Hippo signaling pathway and Notch expression varied in different treatment conditions, suggesting that CoTI may inhibit the ability of Pieris rapae obtain normal growth and development. The qRT-PCR reference gene selection to pierisrapae. The first screening of 8 stable Unigene from the transcriptome database, including Sec61, PSMD9, eIF2g, UPF3, LRE, NADH, hnRNP, THOC2 as candidate reference genes, RPL32, EF1, GADPH and other 3 commonly used reference genes as candidate reference genes, analysis them in different tissues of Pieris rapae, different the development stage and different stress conditions, the relative expression level. Then the analysis using GeNorm and NormFinder software, found that the most stable reference gene expression level of UPF3, so UPF3 is selected as the subsequent quantitative analysis.
【學(xué)位授予單位】：西南交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S433.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1344527