本文關(guān)鍵詞：柴達(dá)木盆地黑果枸杞F3′5′H基因啟動子克隆與活性分析　出處：《青海大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 黑果枸杞 花青素 類黃酮 3′ 5′ 羥化酶合成基因 啟動子 活性分析

【摘要】：黑果枸杞主要分布于我國青海、寧夏、新疆等西部偏遠(yuǎn)地區(qū),是我國西北地區(qū)特有的保持水土和緩解土壤鹽堿化的理想植物。其黑色的果實(shí)中所含的大量花青素具有重要的醫(yī)療保健作用。類黃酮-3′,5′-羥化酶合成基因(F3′5′H基因)是合成使黑果枸杞果實(shí)呈黑色的矮牽牛色素的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因。為闡明F3′5′H基因的表達(dá)機(jī)理,明晰F3′5′H基因在黑果枸杞呈色中的作用,確定黑果枸杞及其白化果實(shí)中F3′5′H基因啟動子的活性,最終揭示黑果枸杞及其白化果實(shí)呈色差異的原因。本研究以黑果枸杞果實(shí)為研究對象,以其白化果實(shí)為對照,首先確定了兩者中F3′5′H基因的表達(dá)模式,繼而克隆黑果枸杞果實(shí)F3′5′H基因全長cDNA序列,以該序列為模板,設(shè)計引物克隆兩者中F3′5′H基因的啟動子。將啟動子與GUS基因融合構(gòu)建植物瞬時表達(dá)載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草葉片,煙草培養(yǎng)后進(jìn)行組織化學(xué)染色以確定啟動子的啟動活性。結(jié)果如下:1.利用實(shí)時熒光定量PCR(Real-time PCR)技術(shù)檢測了F3′5′H基因在黑果枸杞及其白化果實(shí)中不同時期的表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)在S2-S5時期,其在黑果枸杞果實(shí)中的表達(dá)量明顯高于白化果實(shí)中的表達(dá)量。2.利用RACE技術(shù)克隆得到長為1689bp的黑果枸杞F3′5′H基因的全長cDNA序列,其中包含長度為1527bp可編碼508個氨基酸的編碼區(qū)。對該全長cDNA序列及其編碼的氨基酸以及蛋白質(zhì)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)黑果枸杞F3′5′H基因的保守性較高,F3′5′H蛋白為非分泌蛋白,多肽鏈內(nèi)部含有57個磷酸化位點(diǎn),且蛋白為親水性蛋白。3.利用Genome Walking Kit(TaKaRa)試劑盒通過3次染色體步移克隆出黑果枸杞及其白化果實(shí)F3′5′H基因的啟動子片段并測序。利用DNA MAN軟件分析發(fā)現(xiàn)2個啟動子序列的同源性高達(dá)90.3%,通過在線分析網(wǎng)站Plant Care對啟動子序列進(jìn)行預(yù)測,發(fā)現(xiàn)兩者中均具有多個普遍存在于真核生物啟動子中的基本元件如TATA-Box及CAAT-Box。除此之外,還有防御和脅迫應(yīng)答元件TC-rich repeats、創(chuàng)傷響應(yīng)元件WUN-motif以及多個與光響應(yīng)相關(guān)的元件Sp1、Box I和G-box等。還存在一些其他類型的元件,如與胚乳表達(dá)相關(guān)的元件skin-1 motif和厭氧誘導(dǎo)元件ARE。另外在黑果枸杞啟動子中預(yù)測到與茉莉酸甲酯響應(yīng)相關(guān)的元件TGACG-motif,而在黑果枸杞白化果實(shí)啟動子中沒有預(yù)測到。4.分別將2個啟動子與GUS報告基因融合以構(gòu)建植物瞬時表達(dá)載體,進(jìn)而利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草葉片,煙草培養(yǎng)后,通過組織化學(xué)染色來確定啟動子的啟動活性。結(jié)果表明黑果枸杞及其白化果實(shí)的F3′5′H基因啟動子均具有啟動活性,進(jìn)而利用熒光定量對2個啟動子所驅(qū)動的GUS基因的表達(dá)量進(jìn)行了分析,結(jié)果表明黑果枸杞所驅(qū)動的GUS基因的表達(dá)量是黑果枸杞白化果實(shí)的3.09倍。
[Abstract]:Lycium ruthenium is mainly distributed in remote areas of Western China such as Qinghai, Ningxia and Xinjiang. It is an ideal plant for preserving soil and water and alleviating soil salinization in Northwest China. The large amount of anthocyanins contained in its black fruit has an important health care role. The flavonoid -3 ', 5' - hydroxylase synthesis gene (F3 '5' H gene) is the key node gene to synthesize the black Petunia pigment of the fruit of the black fruit Lycium barbarum. In order to clarify the expression mechanism of F3 '5' H gene, clarify the role of F3 '5' H gene in the coloration of Lycium barbarum L., we determined the activity of F3 '5' H promoter in Lycium barbarum and its albino fruits, and finally revealed the reason of color difference of Lycium barbarum and its albino fruits. In this study, Lycium ruthenicum fruit as the research object, with its whitening fruit as the control, first determine the expression pattern of the F3 '5' H gene, and then cloned Lycium ruthenicum fruit F3 'cDNA 5' full-length H gene sequence to the sequence as a template, primers were designed to clone the F3 '5' H gene promoter. The promoter was fused with GUS gene to construct plant transient expression vector. The tobacco leaves were transformed by Agrobacterium mediated transformation, and histochemical staining was done after tobacco culture to determine promoter activity. The results are as follows: 1. using real-time fluorescence quantitative PCR (Real-time PCR) technique to detect F3 '5' H gene in Lycium ruthenicum fruit in different periods and albino expression patterns found in the S2-S5 period, its expression in Lycium ruthenicum fruit in the fruit was significantly higher than that in the albino scale up. 2., using RACE technology, we cloned the full-length cDNA sequence of 1689bp 'F3' 5 'H gene with a length of 1527bp, encoding 508 amino acids. The full-length cDNA sequence and its encoding amino acids and proteins were analyzed by bioinformatics, conserved found that Lycium ruthenicum F3 '5' H F3 '5' gene, H protein is a non secreted protein, polypeptide chain contains 57 phosphorylation sites, and the protein is a hydrophilic protein. 3., we used Genome Walking Kit (TaKaRa) kit to clone the promoter fragment of Lycium barbarum and its albino F3 '5' H gene and sequenced by 3 chromosome walking. Using DNA MAN software analysis, we found that the homology of 2 promoter sequences was as high as 90.3%. We predicted the promoter sequence by online analysis website Plant Care. It is found that both of them have many basic components which are ubiquitous in eukaryotic promoters, such as TATA-Box and CAAT-Box. In addition, there are defense and stress response components TC-rich repeats, trauma response element WUN-motif and multiple light response components Sp1, Box I and G-box. There are also some other types of components, such as the element skin-1 motif associated with the endosperm expression and the anaerobic inducer, ARE. In addition, TGACG-motif in response to methyl jasmonate was predicted in the promoter of Lycium barbarum, but not in the promoter of Lycium barbarum fruit. 4., the 2 promoters were fused with GUS reporter gene to construct plant transient expression vector, and then Agrobacterium mediated transformation was applied to transform tobacco leaves. After tobacco culture, the promoter activity of promoter was determined by histochemical staining. The results show that Lycium ruthenicum fruit whitening and F3 '5' H gene promoter with promoter activity, and expression of GUS gene by fluorescent quantitative driven on 2 promoter was analyzed. The results show that the expression of GUS gene driven by Lycium ruthenicum is 3.09 times the black fruit wolfberry whitening fruit.
【學(xué)位授予單位】：青海大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S567.19

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本文編號：1342084