本文關(guān)鍵詞：穩(wěn)定表達(dá)西尼羅病毒prM-E蛋白細(xì)胞系的構(gòu)建

  更多相關(guān)文章： 西尼羅病毒 prM-E蛋白 病毒樣顆粒 細(xì)胞系

【摘要】：西尼羅病毒(West Nile Virus,WNV)屬黃病毒科,黃病毒屬,是一種重要的人獸共患傳染病病毒。多種鳥類和哺乳動(dòng)物對(duì)該病毒易感,其中馬受WNV的危害最為嚴(yán)重。人感染該病毒后可導(dǎo)致西尼羅熱,嚴(yán)重者出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,甚至可致死亡。該病毒對(duì)養(yǎng)殖業(yè)和人類健康都構(gòu)成了巨大威脅。WNV尚無(wú)特異性的治療方法,疫苗免疫接種是控制該病的主要措施。目前國(guó)外已經(jīng)報(bào)道了幾種獸用WNV疫苗,我國(guó)尚且沒(méi)有可用的WNV疫苗。傳統(tǒng)減毒活疫苗和滅活疫苗免疫原性比較好,但仍存在缺陷,如滅活苗免產(chǎn)生疫應(yīng)答較慢,只能誘導(dǎo)低水平體液免疫,弱毒疫苗具有有潛在性安全問(wèn)題等,因此研究者們致力于研發(fā)更為安全有效的新型疫苗。研究表明WNV prM-E蛋白能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá),并自我組裝成病毒樣顆粒(VLPs)。該病毒樣顆粒與天然的病毒顆粒在誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答方面有著相似的能力。本實(shí)驗(yàn)室在之前的研究中已經(jīng)利用哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了流行性乙型腦炎病毒(JEV)病毒樣顆粒。因此,本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建一個(gè)能夠持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)WNV VLPs的真核細(xì)胞系,為后續(xù)制備WNV亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。為鑒定細(xì)胞系表達(dá)目的蛋白情況,本實(shí)驗(yàn)制備并篩選了一株WNV prM蛋白特異性單克隆抗體。該單抗細(xì)胞上清和腹水ELISA效價(jià)分別為1:2048和1:409600以上;單抗亞型鑒定結(jié)果表明10F7屬于IgG2a,其輕鏈類型為κ鏈;Western blot和IPMA結(jié)果顯示,該單抗與WNV prM特異性反應(yīng),與JEV無(wú)交叉反應(yīng)。將編碼WNV prM蛋白和E蛋白基因的重組質(zhì)粒pCAG-opti-WNV-prME轉(zhuǎn)染進(jìn)BHK-21細(xì)胞,然后用含有G418的選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng),經(jīng)多次亞克隆并結(jié)合間接免疫熒光(IFA)和抗原捕獲ELISA方法篩選,最終得到一個(gè)能夠穩(wěn)定表達(dá)WNV prM-E蛋白的細(xì)胞系W-92。IFA和流式細(xì)胞術(shù)試驗(yàn)結(jié)果表明該細(xì)胞系持續(xù)到第30代仍然保持高水平的蛋白表達(dá)。對(duì)W-92細(xì)胞系表達(dá)產(chǎn)物分離純化后電鏡觀察,結(jié)果表明prM蛋白可與E蛋白組裝成病毒樣顆粒。將該病毒樣顆粒抗原免疫小鼠后,可檢測(cè)到較高效價(jià)的ELISA抗體;誘導(dǎo)的抗體具有病毒中和作用,對(duì)WNV的中和抗體效價(jià)為1:40,對(duì)JEV的中和效價(jià)介于1:20~1:80,有一定程度的交叉保護(hù)作用。將純化后的VLPs免疫鵝后,其血清的JEV中和效價(jià)介:1:20~1:40之間。在使用JEV病毒P3株對(duì)小鼠致死性病毒攻擊試驗(yàn)中,免疫小鼠保護(hù)率為50%-70%。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了一株能持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)WNV prM-E蛋白的真核細(xì)胞系,為WNV亞單位疫苗的制備及診斷方法的研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 劉衛(wèi)濱,梁國(guó)棟;西尼羅病毒研究進(jìn)展[J];中國(guó)病毒學(xué);2004年01期

2 陳繼明,孫映雪,王志亮,沈朝建,謝仲倫,王希明;西尼羅病毒嚴(yán)重危害中國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[J];科學(xué)通報(bào);2004年07期

3 趙榮樂(lè),鄭光宇;西尼羅病毒與西尼羅熱[J];生物學(xué)通報(bào);2005年01期

4 任軍;西尼羅病毒研究進(jìn)展[J];生命科學(xué);2005年05期

5 高志勇,莊輝;西尼羅病毒研究進(jìn)展[J];中華流行病學(xué)雜志;2005年01期

6 史利軍;呂茂民;邵長(zhǎng)利;章金剛;;西尼羅病毒易感性研究現(xiàn)狀[J];生物技術(shù)通訊;2008年06期

7 ;美專家發(fā)現(xiàn)西尼羅病毒新變異毒株[J];中華中醫(yī)藥學(xué)刊;2009年10期

8 宋春英;;西尼羅病毒研究現(xiàn)狀[J];職業(yè)與健康;2011年12期

9 ;美國(guó)超過(guò)4500人感染西尼羅病毒183人死亡[J];疾病監(jiān)測(cè);2012年10期

10 ;西尼羅病毒病理學(xué)[J];中國(guó)地方病防治雜志;2012年05期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 陳永金;;西尼羅病毒(West Nile Virus)[A];第三屆浙江中西部科技論壇論文集（第九卷 預(yù)防分卷）[C];2006年

2 方美玉;任瑞文;劉建偉;;西尼羅病毒病研究進(jìn)展[A];新發(fā)傳染病防治學(xué)習(xí)研討會(huì)論文集[C];2008年

3 呂茂民;章金剛;;西尼羅病毒篩查與血液相關(guān)傳播[A];中國(guó)輸血協(xié)會(huì)第四屆輸血大會(huì)論文集[C];2006年

4 孫賀庭;丁壯;;一種正在迅速蔓延的致命性病毒——西尼羅病毒[A];人畜共患傳染病防治研究新成果匯編[C];2004年

5 史利軍;尹惠瓊;呂茂民;孫宇;章金剛;;西尼羅病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)技術(shù)[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2009學(xué)術(shù)年會(huì)論文集（下冊(cè)）[C];2009年

6 張久松;張泮河;司炳銀;楊紅;曹務(wù)春;;西尼羅病毒與乙腦病毒生物學(xué)性狀的比較與鑒別[A];2004年中國(guó)科學(xué)院新生病毒性疾病控制學(xué)術(shù)討論會(huì)摘要集[C];2004年

7 項(xiàng)勛;段綱;花群義;周曉黎;董俊;楊云慶;常華;曾昭文;;西尼羅病毒的分子生物學(xué)研究進(jìn)展[A];第六屆全國(guó)會(huì)員代表大學(xué)暨第11次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集（上）[C];2005年

8 趙啟祖;PWMason;;表達(dá)綠色熒光蛋白的西尼羅病毒cDNA構(gòu)建及應(yīng)用[A];全國(guó)人畜共患病學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2006年

9 馬健男;楊濤;徐青元;孫恩成;林燕;步志高;吳東來(lái);;西尼羅病毒NS1蛋白特異性單克隆抗體的制備[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)學(xué)分會(huì)暨中國(guó)免疫學(xué)會(huì)獸醫(yī)免疫分會(huì)第八次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2010年

10 項(xiàng)勛;段綱;花群義;周曉黎;董俊;楊云慶;常華;曾昭文;;西尼羅病毒的分子生物學(xué)研究進(jìn)展[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜傳染病學(xué)分會(huì)第六屆全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨第11次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2005年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 記者 徐啟生;西尼羅病毒肆虐得州17人喪命[N];光明日?qǐng)?bào);2012年

2 本報(bào)記者 李穎;人們?cè)撊绾螒?yīng)對(duì)西尼羅病毒？[N];科技日?qǐng)?bào);2012年

3 記者 鄭靈巧;西尼羅病毒不會(huì)“人傳人”[N];健康報(bào);2012年

4 記者 鄭思　通訊員 胡辛楠 蔣麗娟;我市尚未發(fā)現(xiàn)西尼羅病毒[N];深圳商報(bào);2012年

5 高原;美發(fā)現(xiàn)西尼羅病毒變異毒株[N];中國(guó)國(guó)門時(shí)報(bào);2008年

6 毛磊;西尼羅病毒在美蔓延原因新解[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2004年

7 記者王俊鳴;西尼羅病毒蔓延美國(guó)[N];科技日?qǐng)?bào);2002年

8 張亮;西尼羅病毒已成為美國(guó)地方流行病[N];科技日?qǐng)?bào);2003年

9 宋心德;科學(xué)家發(fā)現(xiàn)鳥傳播西尼羅病毒[N];光明日?qǐng)?bào);2005年

10 駐華盛頓記者 夏曉陽(yáng);美國(guó)暴發(fā)同期最嚴(yán)重西尼羅疫情[N];文匯報(bào);2012年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前7條

1 姜淑芳;中國(guó)重要庫(kù)蚊屬蚊蟲傳播西尼羅病毒的實(shí)驗(yàn)研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2006年

2 劉志國(guó);西尼羅病毒多表位疫苗研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2007年

3 張曉龍;蚊—鳥—蚊循環(huán)在西尼羅病毒傳播中的作用研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2007年

4 史利軍;西尼羅病毒核酸及抗體檢測(cè)體系的建立與評(píng)價(jià)[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

5 李曉峰;西尼羅病毒Chin-01株5’非編碼區(qū)與病毒復(fù)制相關(guān)蛋白的相互作用研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2008年

6 張映梅;我國(guó)白紋伊蚊和埃及伊蚊傳播西尼羅病毒的實(shí)驗(yàn)研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2006年

7 孫恩成;西尼羅病毒NS1蛋白對(duì)乙型腦炎病毒交叉保護(hù)作用研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2012年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前7條

1 郭立平;穩(wěn)定表達(dá)西尼羅病毒prM-E蛋白細(xì)胞系的構(gòu)建[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

2 王玉春;西尼羅病毒免疫診斷方法的建立及對(duì)入境人員的血清調(diào)查[D];河南師范大學(xué);2014年

3 曹飛;西尼羅病毒DNA形式復(fù)制子的構(gòu)建及免疫原性研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2011年

4 孫后超;西尼羅病毒E蛋白Ⅲ區(qū)的原核表達(dá)及其對(duì)西尼羅病毒感染的免疫保護(hù)作用[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2010年

5 寧北芳;乙腦病毒和西尼羅病毒單克隆抗體的制備及鑒定[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2006年

6 張翠云;西尼羅病毒E蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建以及對(duì)小鼠的免疫原性[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

7 廖玉學(xué);湖南省部分地區(qū)蝙蝠攜帶某些蚊媒病毒的調(diào)查研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2008年

，

本文編號(hào)：1296312