本文關鍵詞：蕓薹生鏈格孢（Alternaria brassicicola）AbSte12基因的鑒定及功能研究

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【摘要】：蕓薹生鏈格孢(Alternaria brassicicola)對環(huán)境與寄主有很強的適應性,廣泛分布于自然界中,常引起十字花科蔬菜黑斑病,造成嚴重的經濟損失。此外,蕓薹生鏈格孢也是世界上許多地區(qū)的氣源性致病源,已經成為日益公認的導致哮喘、致命性哮喘惡化的危險因素。早期研究顯示,FUS3/KSS1-MAPK信號途徑在蕓薹生鏈格孢致病過程中起到重要的調控作用,但對于其下游轉錄因子STE12的功能、作用機理及調控基因尚不清楚。本研究主要以蕓薹生鏈格孢菌(A.brassicicola)為對象,通過構建AbSte12基因缺失突變體(ΔAbSte12)、AbSte12基因互補體(C),與野生菌(Wild-type,WT)對比研究,進而深入了解轉錄因子STE12的生物學功能,分析其下游靶標基因,探索其調控機制。主要結果如下:1.AbSte12基因的生物信息學分析。以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Ste12(NP_011952.1)和大麥網斑病菌(Pyrenophora teres f.teres)的一個同源基因(XP_003303640.1)為查詢,在已構建的蕓薹生鏈格孢基因組數(shù)據(jù)庫中進行本地比對,找到A.brassicicola中Ste12的同源基因,命名為AbSte12。設計特異性引物從蕓薹生鏈格孢菌中成功擴增AbSte12基因DNA及cDNA,該基因全長2364bp,含有3個內含子,cDNA 2091bp,編碼696個氨基酸。DNAMAN分析顯示Ab Ste12與不同Ste12-like基因氨基酸序列具有很高的同源性。通過SMART預測網站對A.brassicicola Ste12氨基酸序列進行分析,發(fā)現(xiàn)該基因與其他多數(shù)Ste12-like基因編碼的氨基酸序列N末端都具有典型的Ste-homolog結構域,C末端包含兩個C2H2的鋅指結構域,而后者在釀酒酵母中不存在。利用MEGA6.0分析不同Ste12-like基因系統(tǒng)進化關系,顯示A.brassicicola AbSte12與灰葡萄孢(Botrytis cinerea)Ste12、菌核雪腐病菌(Sclerotinia borealis)Ste12親緣關系最近。2.ΔAbSte12突變體的構建。構建AbSte12打靶載體A+M+B,獲取A.brassicicola原生質體并通過PEG介導進行轉化,在含有潮霉素的培養(yǎng)基上篩選出轉化子,設計特異性引物通過普通PCR驗證篩選,得到ΔAbSte12突變體。此外,通過Southern雜交技術驗證為潮霉素磷酸轉移酶基因單拷貝插入ΔAbSte12突變體。3.AbSte12基因的功能研究。在菌落表型、分生孢子的形成、致病力以及菌絲穿透能力等方面對比分析ΔAbSte12突變體與野生菌的差異。結果發(fā)現(xiàn)ΔAbSte12突變體在PDA培養(yǎng)基上生長速度減緩且不能產生成熟分生孢子。采用離體葉片接種法接種油菜葉片,ΔAbSte12突變體不能侵染葉片組織,致病力喪失。此外,利用覆有滅菌玻璃紙的PDA的培養(yǎng)基培養(yǎng)ΔAbSte12突變體及野生菌,發(fā)現(xiàn)ΔAbSte12突變體不能穿透玻璃紙再次生長。構建互補體后,其生物學性狀等均恢復到野生菌水平。由此可以推測,在蕓薹生鏈格孢菌中,AbSte12基因參與調控菌絲營養(yǎng)體生長、分生孢子的形成、穿透力以及致病性。4.AbSte12基因下游部分調控基因的鑒定。利用Real time PCR技術對ΔAbSte12突變體及野生菌cDNA進行對比分析,結果初步證實轉錄因子Ab Ste12的部分下游調控基因為AbBud8、Ab Bem1、AbPck1、Ab Chs7、AbSho1、AbPrm2。
【學位授予單位】：山東農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S432.4

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