本文關(guān)鍵詞：豬傳染性胃腸炎病毒抗體檢測(cè)iELISA的建立及S1基因重組乳酸菌載體的構(gòu)建

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【摘要】：豬傳染性胃腸炎(TGE)是豬的一種急性,高度傳染性的腸道病毒疫病,以2周齡以下仔豬嘔吐、嚴(yán)重腹瀉、脫水和高死亡率為主要特征�？焖僭\斷、及時(shí)監(jiān)測(cè)和接種疫苗是防控豬傳染性胃腸炎的主要措施。ELISA是檢測(cè)TGEV抗體的最常用方法,也是國(guó)際動(dòng)物衛(wèi)生組織推薦使用的方法。目前我國(guó)使用的TGEV抗體檢測(cè)ELISA商品試劑盒均為價(jià)格昂貴的國(guó)外產(chǎn)品,我國(guó)自主研制TGEV抗體檢測(cè)ELISA試劑盒迫在眉睫。當(dāng)今用于該病防控的疫苗主要是全病毒弱毒疫苗和滅活疫苗,但弱毒疫苗存在毒力返強(qiáng)的安全隱患,滅活疫苗免疫效果不盡如人意,研究安全有效的基因工程疫苗十分必要。本研究立足于豬傳染性胃腸炎的防控關(guān)鍵技術(shù),構(gòu)建TGEV N基因表達(dá)載體并在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá),采用表達(dá)的可溶性N蛋白作為包被抗原,研究建立了 ELISA抗體檢測(cè)技術(shù)。出于對(duì)新型可飼性基因工程疫苗的探索,本研究利用乳酸菌作為載體,進(jìn)行了 S1基因重組乳酸菌載體的構(gòu)建,研究成果為進(jìn)一步進(jìn)行新型疫苗研究建立基礎(chǔ)。1.TGEV N基因的克隆及原核表達(dá)根據(jù)GenBank中豬傳染性胃腸炎毒株N蛋白基因序列,設(shè)計(jì)合成特異性引物,經(jīng)RT-PCR獲得大小為1179bp的N蛋白基因。將N蛋白基因亞克隆到原核表達(dá)載體pColdⅡ中構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pColdⅡ-N,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)了可溶性N蛋白,經(jīng)鎳瓊脂糖凝膠樹(shù)脂親和層析柱和苯基疏水柱層析純化,SDS-PAGE和Western-blotting分析表明,重組N蛋白大小約為45ku,與預(yù)期結(jié)果相符,與TGEV抗血清有良好的免疫反應(yīng)活性,可作為檢測(cè)用抗原建立抗體檢測(cè)技術(shù)。2.TGEV iELISA檢測(cè)技術(shù)的建立利用純化的重組表達(dá)的可溶性N蛋白作為包被抗原,優(yōu)化ELISA反應(yīng)條件,建立了可檢測(cè)TGEV抗體的間接ELISA方法。試驗(yàn)結(jié)果表明,間接ELISA最佳抗原包被量為每孔101.5ng,4℃包被過(guò)夜;最佳封閉條件為使用含1%BSA的PBS封閉1h;最佳待檢血清反應(yīng)條件為按1:100倍稀釋作用1小時(shí);最佳酶標(biāo)二抗作用條件為按1:10000倍稀釋37℃反應(yīng)1h。按最佳反應(yīng)條件,對(duì)56份陰性血清的檢測(cè)結(jié)果表明,其陰陽(yáng)性臨界值為0.445。試驗(yàn)表明建立的間接ELISA檢測(cè)方法具有良好的特異性、重復(fù)性,與PoRV、PEDV陽(yáng)性血清無(wú)交叉反應(yīng),與西班牙INGENASA公司生產(chǎn)的豬傳染性胃腸炎抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果符合率達(dá)94.1%。3.分泌表達(dá)豬傳染性胃腸炎S1基因重組乳酸菌載體的構(gòu)建本研究同時(shí)對(duì)包含A、D兩個(gè)抗原位點(diǎn)的一段TGEV S基因序列(S1)按照乳酸菌密碼子偏愛(ài)性進(jìn)行了優(yōu)化,并且在優(yōu)化后的S1基因前面加入了乳酸乳球菌信號(hào)肽Usp45和帶有負(fù)電荷的9個(gè)氨基酸殘基組成的短肽LEISSTCDA,人工合成優(yōu)化后的片段,克隆入乳酸菌表達(dá)載體系統(tǒng)中,構(gòu)建了重組乳酸菌表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化入宿主菌NZ9000中,Western-blotting結(jié)果顯示,經(jīng)Nisin誘導(dǎo)后,S1蛋白在乳酸菌中得到了有效表達(dá),且表達(dá)產(chǎn)物分泌于胞外。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S858.28

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