發(fā)布時(shí)間：2017-12-12 08:02

  本文關(guān)鍵詞：豬瘟病毒E2蛋白單克隆抗體的制備及其表位鑒定分析

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【摘要】：豬瘟(classical swine fever,CSF)是由豬瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)引起的一種高度接觸性、致死性傳染病。在CSFV編碼的結(jié)構(gòu)蛋白中,E2囊膜蛋白作為CSFV主要免疫原性蛋白,能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體,是新型疫苗的主要研究對(duì)象,也是建立CSFV血清學(xué)檢測(cè)方法的首選抗原。以CSFV E2蛋白作為免疫原制備的單克隆抗體具有病毒中和能力,在CSFV的生物學(xué)特性、抗原性及表位研究、免疫學(xué)診斷、流行病學(xué)研究等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。已有研究證明E2蛋白上存在多個(gè)抗原表位,包括線性表位和構(gòu)象表位。為進(jìn)一步對(duì)E2蛋白表位進(jìn)行定位和分析,本研究采用桿狀病毒表達(dá)豬瘟病毒C株E2蛋白作為免疫原蛋白,免疫BABL/c小鼠,通過(guò)細(xì)胞融合、篩選及亞克隆,獲得4株抗CSFV E2蛋白單抗,分別命名為E2-1,E2-2,E2-3,E2-4。經(jīng)測(cè)定4株單抗均屬于IgG1亞型,輕鏈為κ鏈。制備腹水并純化單抗,鑒定結(jié)果顯示4株單抗抗體效價(jià)分別為1:102400、1:102400、1:204800、1:102400,而且均能與豬瘟C株發(fā)生反應(yīng),與BVDV無(wú)交叉反應(yīng),均能中和CSFV Thiveral株,其中單抗E2-3與Thiveral株的中和效價(jià)高達(dá)1.6×105倍。為進(jìn)一步鑒定單抗識(shí)別的抗原表位,從所篩選的4株單克隆抗體中,選擇病毒中和活性和效價(jià)最高的單抗E2-3進(jìn)行表位鑒定。本實(shí)驗(yàn)采用PEPperMAP?表位圖譜技術(shù),按照豬瘟病毒C株E2全長(zhǎng)(除跨膜區(qū)),用多肽重置的方法人工合成314條長(zhǎng)度為15個(gè)氨基酸的多肽,制備多肽芯片,用單抗E2-3進(jìn)行反應(yīng),發(fā)現(xiàn)存在一條9個(gè)氨基酸的特異性多肽序列(正在申請(qǐng)國(guó)家專(zhuān)利)與單抗E2-3特異性結(jié)合,且與國(guó)際上著名的單抗WH303表位(TAVSPTTLR)不在同一位點(diǎn)。為進(jìn)一步確定該表位的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn),本研究對(duì)篩選出來(lái)的特異多肽序列,采用氨基酸替換實(shí)驗(yàn),將表位中氨基酸逐一替換,制備多肽芯片,與單抗E2-3反應(yīng)分析。結(jié)果顯示單抗E2-3與酸性氨基酸(D、E)和芳香族氨基酸(W、Y)親和能力較強(qiáng),而抗原表位中存在3個(gè)天冬氨酸(D)與之對(duì)應(yīng)。因此推測(cè)該表位中的3個(gè)D可能為關(guān)鍵的結(jié)合位點(diǎn)。為了驗(yàn)證表位中的3個(gè)D是否為關(guān)鍵的結(jié)合位點(diǎn),本實(shí)驗(yàn)在多肽水平表位鑒定的基礎(chǔ)上進(jìn)一步了研究3個(gè)D的作用機(jī)制。利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行關(guān)鍵氨基酸突變表達(dá)試驗(yàn),在桿狀病毒CSFV E2蛋白轉(zhuǎn)移載體上對(duì)3個(gè)D分別進(jìn)行單一突變、雙突變、三突變,對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行反應(yīng)鑒定。結(jié)果顯示單抗E2-3與突變后表達(dá)產(chǎn)物結(jié)合能力并未出現(xiàn)明顯的下降,推測(cè)這3個(gè)D位點(diǎn)可能并不是關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn),而是由多個(gè)氨基酸位點(diǎn)共同決定,其作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。為了確定單抗E2-3與不同基因亞型CSFV廣譜性,實(shí)驗(yàn)中復(fù)壯分離了22株CSFV流行毒株,并對(duì)其進(jìn)行E2基因主要編碼區(qū)序列分析。發(fā)現(xiàn)22株流行毒株分屬1.1、2.1和2.2三個(gè)基因亞型,并以2.1基因亞型毒株為主。而對(duì)22株CSFV流行毒株與單抗E2-3進(jìn)行反應(yīng)性分析后發(fā)現(xiàn),單抗E2-3與三個(gè)基因亞型毒株均發(fā)生反應(yīng),證明單抗E2-3具有廣譜性,但只與9株2.1亞型毒株不發(fā)生反應(yīng),說(shuō)明不同流行毒株之間存在一定抗原譜差異。綜上所述,本研究制備了4株特異性抗CSFV E2蛋白單克隆抗體,均具有病毒中和活性。對(duì)其中的一株抗體效價(jià)最高的單抗E2-3進(jìn)行抗原表位鑒定,確定了一個(gè)不同于國(guó)際上著名的單抗WH303的線性表位(正在申請(qǐng)專(zhuān)利);采用氨基酸替換和突變研究,發(fā)現(xiàn)鑒定表位中的3個(gè)D并不是關(guān)鍵位點(diǎn),推測(cè)可能是由多個(gè)氨基酸共同影響單抗E2-3的結(jié)合能力;同時(shí),通過(guò)該單抗E2-3與不同流行毒株反應(yīng)性分析,證明CSFV流行毒株具有不同的抗原譜。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：1281734