本文關(guān)鍵詞：BHK-21懸浮細(xì)胞高密度克隆株的篩選及培養(yǎng)優(yōu)化

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【摘要】：BHK-21細(xì)胞是WHO推薦的獸用疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì),BHK-21細(xì)胞懸浮培養(yǎng)模式在規(guī)模化生產(chǎn)中取得了廣泛的應(yīng)用。懸浮培養(yǎng)技術(shù)較傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶貼壁培養(yǎng)工藝在疫苗產(chǎn)量和質(zhì)量上均有明顯優(yōu)勢(shì),該技術(shù)已在我國口蹄疫疫苗生產(chǎn)中得到應(yīng)用。懸浮培養(yǎng)技術(shù)中懸浮細(xì)胞株的馴化、個(gè)性化培養(yǎng)基開發(fā)和生物反應(yīng)器培養(yǎng)工藝是培養(yǎng)工藝的三個(gè)關(guān)鍵因素,也是未來研究的主要方向。目前在疫苗生產(chǎn)中BHK-21細(xì)胞雖以懸浮型的模式在培養(yǎng),但其細(xì)胞密度與工業(yè)化生產(chǎn)所需高細(xì)胞密度相差較大。懸浮型BHK-21細(xì)胞株與貼壁型細(xì)胞一樣,在群體倍增過程中單細(xì)胞生長差異較大,有的細(xì)胞長得快,有的細(xì)胞長得慢,有的細(xì)胞耐久力長,有的細(xì)胞耐久力短。單細(xì)胞克隆株細(xì)胞由同一個(gè)細(xì)胞增殖而來,因此有較強(qiáng)的同源性、穩(wěn)定的遺傳性和均一的生物學(xué)性狀,本試驗(yàn)試圖通過單細(xì)胞培養(yǎng)法對(duì)現(xiàn)有懸浮細(xì)胞系進(jìn)行單細(xì)胞克隆,對(duì)單細(xì)胞克隆株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),將生長快、耐久力長的克隆株進(jìn)行凍存,對(duì)凍存的克隆細(xì)胞株根據(jù)倍增時(shí)間、最大增殖密度篩選出能高密度生長的單克隆細(xì)胞株。本研究首先對(duì)甘肅省動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心自主馴化的BHK-21懸浮細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)特性鑒定。鑒定合格的BHK-21懸浮細(xì)胞,用有限稀釋法按照每孔1個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔U型培養(yǎng)板、96孔平底培養(yǎng)板、24孔瓊脂層培養(yǎng)板中進(jìn)行單細(xì)胞克隆。單細(xì)胞經(jīng)過12d的培養(yǎng)長滿培養(yǎng)孔底部,擴(kuò)大培養(yǎng)單克隆細(xì)胞獲得14個(gè)單克隆細(xì)胞株,建立了相應(yīng)的細(xì)胞庫。復(fù)蘇單細(xì)胞克隆株進(jìn)行單克隆的篩選,其中4個(gè)單克隆細(xì)胞生長比其他克隆細(xì)胞株具有明顯的優(yōu)勢(shì)。對(duì)4個(gè)單細(xì)胞克隆株的生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定,并與克隆前的BHK-21懸浮細(xì)胞各項(xiàng)生物學(xué)特性進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示,單細(xì)胞克隆株的各項(xiàng)生物學(xué)特性穩(wěn)定、未發(fā)生變異,克隆得到穩(wěn)定生長的細(xì)胞株,建立了懸浮細(xì)胞單細(xì)胞克隆的可行方法。對(duì)4株單細(xì)胞克隆株進(jìn)行口蹄疫病毒146S抗原表達(dá)測(cè)定,其中CL18克隆株表達(dá)抗原最高為2.70μg/ml,確定了 CL18克隆株為最優(yōu)細(xì)胞株。對(duì)CL18克隆株的生長特性進(jìn)行研究,確定了以6.0×105/ml為最佳接種密度,在搖瓶中批培養(yǎng)細(xì)胞最大增值密度為834×104/ml;以48h和72h流加培養(yǎng)的方式培養(yǎng)細(xì)胞最大增值密度為905×104/ml。利用5LNBS生物反應(yīng)器培養(yǎng)CL18細(xì)胞,60×104/ml的接種密度接種細(xì)胞,批培養(yǎng)的方式進(jìn)行培養(yǎng),在72h時(shí)細(xì)胞增殖密度達(dá)到最大值為741×104/ml;,以60×104/ml的接種密度接種細(xì)胞,以48h和72h進(jìn)行流加的方式進(jìn)行培養(yǎng),在120h時(shí)細(xì)胞增殖密度達(dá)到最大值為921×104/ml。說明經(jīng)篩選鑒定的單克隆BHK-21CL18株具有在FMD疫苗生產(chǎn)應(yīng)用的良好前景。
【學(xué)位授予單位】：西北民族大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q813;S859.797

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本文編號(hào)：1271494