本文關鍵詞：BHK-21懸浮細胞高密度克隆株的篩選及培養(yǎng)優(yōu)化

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【摘要】：BHK-21細胞是WHO推薦的獸用疫苗生產用細胞基質,BHK-21細胞懸浮培養(yǎng)模式在規(guī)�；a中取得了廣泛的應用。懸浮培養(yǎng)技術較傳統(tǒng)的轉瓶貼壁培養(yǎng)工藝在疫苗產量和質量上均有明顯優(yōu)勢,該技術已在我國口蹄疫疫苗生產中得到應用。懸浮培養(yǎng)技術中懸浮細胞株的馴化、個性化培養(yǎng)基開發(fā)和生物反應器培養(yǎng)工藝是培養(yǎng)工藝的三個關鍵因素,也是未來研究的主要方向。目前在疫苗生產中BHK-21細胞雖以懸浮型的模式在培養(yǎng),但其細胞密度與工業(yè)化生產所需高細胞密度相差較大。懸浮型BHK-21細胞株與貼壁型細胞一樣,在群體倍增過程中單細胞生長差異較大,有的細胞長得快,有的細胞長得慢,有的細胞耐久力長,有的細胞耐久力短。單細胞克隆株細胞由同一個細胞增殖而來,因此有較強的同源性、穩(wěn)定的遺傳性和均一的生物學性狀,本試驗試圖通過單細胞培養(yǎng)法對現有懸浮細胞系進行單細胞克隆,對單細胞克隆株進行擴大培養(yǎng),將生長快、耐久力長的克隆株進行凍存,對凍存的克隆細胞株根據倍增時間、最大增殖密度篩選出能高密度生長的單克隆細胞株。本研究首先對甘肅省動物細胞工程技術研究中心自主馴化的BHK-21懸浮細胞進行生物學特性鑒定。鑒定合格的BHK-21懸浮細胞,用有限稀釋法按照每孔1個細胞的密度接種于96孔U型培養(yǎng)板、96孔平底培養(yǎng)板、24孔瓊脂層培養(yǎng)板中進行單細胞克隆。單細胞經過12d的培養(yǎng)長滿培養(yǎng)孔底部,擴大培養(yǎng)單克隆細胞獲得14個單克隆細胞株,建立了相應的細胞庫。復蘇單細胞克隆株進行單克隆的篩選,其中4個單克隆細胞生長比其他克隆細胞株具有明顯的優(yōu)勢。對4個單細胞克隆株的生物學特性進行鑒定,并與克隆前的BHK-21懸浮細胞各項生物學特性進行對比。結果顯示,單細胞克隆株的各項生物學特性穩(wěn)定、未發(fā)生變異,克隆得到穩(wěn)定生長的細胞株,建立了懸浮細胞單細胞克隆的可行方法。對4株單細胞克隆株進行口蹄疫病毒146S抗原表達測定,其中CL18克隆株表達抗原最高為2.70μg/ml,確定了 CL18克隆株為最優(yōu)細胞株。對CL18克隆株的生長特性進行研究,確定了以6.0×105/ml為最佳接種密度,在搖瓶中批培養(yǎng)細胞最大增值密度為834×104/ml;以48h和72h流加培養(yǎng)的方式培養(yǎng)細胞最大增值密度為905×104/ml。利用5LNBS生物反應器培養(yǎng)CL18細胞,60×104/ml的接種密度接種細胞,批培養(yǎng)的方式進行培養(yǎng),在72h時細胞增殖密度達到最大值為741×104/ml;,以60×104/ml的接種密度接種細胞,以48h和72h進行流加的方式進行培養(yǎng),在120h時細胞增殖密度達到最大值為921×104/ml。說明經篩選鑒定的單克隆BHK-21CL18株具有在FMD疫苗生產應用的良好前景。
【學位授予單位】：西北民族大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q813;S859.797

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本文編號：1271494