本文關(guān)鍵詞：Bta-miR-224調(diào)控奶牛乳腺上皮細(xì)胞TG生成和凋亡機(jī)制的研究

  更多相關(guān)文章： 奶牛乳腺上皮細(xì)胞 bta-miR-224 ACADM ALDH2

【摘要】：miRNAs是一類非編碼的小RNA,能夠通過靶向?qū)?yīng)的靶基因,進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的調(diào)控,以便調(diào)控人類、動(dòng)物和植物的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞凋亡以及癌癥的發(fā)生等生物學(xué)過程。與mi R-224相關(guān)的研究多數(shù)集中在疾病的研究中,研究表明mi R-224參與細(xì)胞的增殖和凋亡等生物過程,與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)。最近,研究人員發(fā)現(xiàn)mi R-224參與小鼠脂肪細(xì)胞的分化,調(diào)控豬脂肪的形成和沉積等,都說明mi R-224在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮著重要的作用。但是,bta-miR-224對(duì)奶牛乳脂代謝調(diào)控機(jī)制尚不明確。因此本研究旨在通過驗(yàn)證bta-miR-224與脂質(zhì)代謝相關(guān)的新的靶基因,并對(duì)bta-miR-224的生物學(xué)功能進(jìn)行驗(yàn)證。為深入了解bta-miR-224在乳脂代謝調(diào)節(jié)中的作用提供依據(jù),從而為生產(chǎn)實(shí)踐提供一定的理論基礎(chǔ)和指導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)第一步利用生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)出bta-miR-224可能的靶基因ACADM和ALDH2。接下來用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)來驗(yàn)證bta-miR-224與ACADM、ALDH2基因之間的識(shí)別位點(diǎn),結(jié)果顯示,共轉(zhuǎn)染bta-miR-224 mimics和ACADM 3’UTR野生型序列后的細(xì)胞熒光活性顯著低于共轉(zhuǎn)染了bta-miR-224 mimics和ACADM突變型載體序列后的細(xì)胞的熒光活性(p0.05),共轉(zhuǎn)染了bta-miR-224 mimics和ACADM突變型載體組與共轉(zhuǎn)染了bta-miR-224 mimics和空載載體組相比,細(xì)胞熒光活性無顯著性差異(p0.05)。ALDH2基因的表達(dá)趨勢(shì)相同。結(jié)果表明,在ACADM(498bp-504bp)和ALDH2(219bp-225bp)基因的3’UTR上存在與bta-miR-224成熟序列特異性結(jié)合的位點(diǎn),bta-miR-224與ACADM和ALDH2基因存在靶標(biāo)關(guān)系,ACADM和ALDH2基因是bta-miR-224的靶基因。為了探究bta-miR-224對(duì)ACADM和ALDH2基因在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控作用,利用實(shí)時(shí)熒光定量法檢測(cè)了bta-miR-224和它的靶基因在奶牛的乳腺上皮細(xì)胞中差異表達(dá)水平。結(jié)果顯示,bta-miR-224的相對(duì)表達(dá)量為:轉(zhuǎn)染bta-miR-224 mimics組表達(dá)量極顯著高于轉(zhuǎn)染bta-miR-224 inhibitor組和shNC組(p0.01)。q PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)染了載體的奶牛乳腺上皮細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染bta-miR-224 mimics組,ACADM相對(duì)表達(dá)量顯著低于轉(zhuǎn)染shNC組和轉(zhuǎn)染bta-miR-224 inhibitor組(p0.05),轉(zhuǎn)染shNC組與轉(zhuǎn)染mi R-224 inhibitor組ACADM的表達(dá)量無顯著差異(p0.05)。ALDH2基因的相對(duì)表達(dá)量為:轉(zhuǎn)染bta-miR-224 mimics組的乳腺上皮細(xì)胞,ALDH2相對(duì)表達(dá)量顯著低于轉(zhuǎn)染shNC組和轉(zhuǎn)染bta-miR-224 inhibitor組(p0.05),轉(zhuǎn)染shNC組與轉(zhuǎn)染bta-miR-224 inhibitor組ALDH2的表達(dá)量無顯著差異(p0.05)。經(jīng)過SPSS 22.0軟件相關(guān)性分析表明:bta-miR-224和ACADM、ALDH2基因之間存在負(fù)向調(diào)控的關(guān)系。以上研究表明,bta-miR-224能夠在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)ACADM、ALDH2基因進(jìn)行調(diào)控,并且驗(yàn)證了bta-miR-224在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)ACADM和ALDH2基因有下調(diào)作用。為進(jìn)一步探究bta-miR-224在ACADM和ALDH2基因翻譯水平發(fā)揮的作用,通過Western blot檢驗(yàn)ACADM、ALDH2基因蛋白水平的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染bta-miR-224mimics組ACADM、ALDH2基因的蛋白表達(dá)量顯著低于轉(zhuǎn)染bta-miR-224 inhibitor組和shNC組(p0.05),轉(zhuǎn)染bta-miR-224 inhibitor組和shNC組的ACADM、ALDH2基因的蛋白表達(dá)量無顯著差異(p0.05)。結(jié)果表明,在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中,bta-miR-224能夠?qū)CADM、ALDH2基因進(jìn)行翻譯水平的調(diào)控,其通過靶向ACADM、ALDH2基因?qū)CADM、ALDH2蛋白表達(dá)量進(jìn)行調(diào)控,并且bta-miR-224對(duì)ACADM、ALDH2基因在蛋白水平上有負(fù)調(diào)控的作用。甘油三酯生成量檢測(cè)結(jié)果說明,bta-miR-224 mimics組的乳腺上皮細(xì)胞中甘油三酯的產(chǎn)量顯著低于shNC組的表達(dá)量(p0.01),而bta-miR-224 inhibitor組甘油三酯的表達(dá)量顯著高于轉(zhuǎn)染shNC組(p0.05)。在此之后,我們調(diào)試了流式細(xì)胞儀,進(jìn)行檢測(cè)乳腺上皮細(xì)胞凋亡情況,結(jié)果顯示,bta-miR-224 mimics組細(xì)胞凋亡率高于轉(zhuǎn)染bta-miR-224inhibitor組和shNC組細(xì)胞凋亡率。結(jié)果表明,bta-miR-224的高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致乳腺上皮細(xì)胞凋亡率增加。結(jié)論:(1)ACADM和ALDH2基因是bta-miR-224的靶基因;(2)在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中,bta-miR-224能夠?qū)CADM和ALDH2基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的調(diào)控,可以降解ACADM和ALDH2基因靶m RNA的表達(dá),并且抑制ACADM和ALDH2基因翻譯成蛋白質(zhì);(3)bta-miR-224高表達(dá)會(huì)降低奶牛的乳腺上皮細(xì)胞中甘油三酯的生產(chǎn)并且能夠促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的凋亡比率,提示bta-miR-224會(huì)參與奶牛的乳脂代謝過程,并且影響乳腺組織的生長(zhǎng)發(fā)育,從而影響奶牛的泌乳情況。
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S823

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 王月影;朱河水;王艷玲;;乳腺上皮細(xì)胞的鈣轉(zhuǎn)運(yùn)研究進(jìn)展[J];江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2008年06期

2 楊櫟;李鍵;吳媛媛;田甜;畢琳;梁天宇;;綠色熒光蛋白基因在牦牛乳腺上皮細(xì)胞中表達(dá)的研究[J];西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2009年03期

3 吳媛媛;李鍵;楊櫟;畢琳;田甜;;牦牛乳腺上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)的研究[J];西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2009年04期

4 弓超;王凌云;周歡敏;;牛乳腺上皮細(xì)胞體外分離和培養(yǎng)[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2011年07期

5 李吉霞;葛秀國(guó);王文秀;張涌;;牛乳腺上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2012年07期

6 符梅;熊顯榮;高川;李宇;王樹茂;李鍵;;麥洼牦牛乳腺上皮細(xì)胞系的建立及其生物學(xué)特性[J];西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2012年11期

7 郝明超;劉r，

本文編號(hào)：1268980