本文關(guān)鍵詞：中華絨螯蟹解毒基因及其相關(guān)酶對(duì)多環(huán)芳烴的響應(yīng)

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【摘要】：多環(huán)芳烴(Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是存在于水環(huán)境中的具致癌、致畸和致突變性的持久性有機(jī)污染物,進(jìn)入機(jī)體后可通過(guò)Ⅰ、Ⅱ相代謝酶進(jìn)行代謝。為研究中華絨螯蟹暴露于多環(huán)芳烴時(shí)其機(jī)體內(nèi)Ⅰ相代謝酶CYP家族基因和Ⅱ相代謝酶GST基因及它們相關(guān)酶的響應(yīng)情況,本論文選取菲、(?)和苯并芘代表三環(huán)、四環(huán)和五環(huán)多環(huán)芳烴進(jìn)行相關(guān)研究。一.基因克隆及其組織分布研究本研究獲得中華絨螯蟹的CYP2A基因片段(861bp),及CYP2B和CYP4兩基因完整開(kāi)放閱讀框(1476bp和1557bp)。相關(guān)生物信息學(xué)及進(jìn)化樹(shù)結(jié)果證實(shí)本研究所獲基因?qū)儆贑YP家族。本研究四種基因未攻毒時(shí)于中華絨螯蟹體內(nèi)普遍存在,其中,肝胰腺、鰓、血淋巴和肌肉表達(dá)相對(duì)較高。二.毒物暴露對(duì)基因表達(dá)量及其相關(guān)酶活性的影響選擇基因表達(dá)量高的肝胰腺、鰓、血淋巴和肌肉作為檢測(cè)組織,在多環(huán)芳烴暴露條件下,研究四種基因的表達(dá)量及其相關(guān)酶活性隨暴露濃度和暴露時(shí)間變化的情況。(一)菲暴露對(duì)基因表達(dá)量及其相關(guān)酶活性的影響暴露濃度實(shí)驗(yàn):設(shè)置6個(gè)菲濃度(0、100、200、400、600和800μg/L),于24h檢測(cè)肝胰腺中目的基因表達(dá)及相關(guān)酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),CYP2A和CYP4基因的呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì),CYP2B基因呈現(xiàn)先降低后升高再降低趨勢(shì),而GST基因則處于持續(xù)上升狀態(tài),CYP2A、CYP2B、CYP4、GST基因分別于菲濃度400、600、200和800μg/L時(shí)達(dá)到最高值。而CYP4和GST基因?qū)Ψ茲舛仍黾痈舾?分別于菲濃度200和800μg/L時(shí)有顯著差異(P0.05)。酶活性檢測(cè)的結(jié)果發(fā)現(xiàn),APND、ERND和GST活性隨菲濃度升高呈現(xiàn)升高后降低的趨勢(shì),前兩者于600ng/μL時(shí)達(dá)到高值;而GST酶則于400μg/L時(shí)達(dá)到高值�？傊�,本研究設(shè)定的菲濃度條件下APND、ERND、GST三種酶的活性均顯著高于對(duì)照組(P0.05),說(shuō)明中華絨螯蟹肝胰腺中這三種酶對(duì)菲十分敏感。暴露時(shí)間實(shí)驗(yàn):根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,于安全濃度范圍內(nèi)設(shè)置200 μg/L的菲濃度開(kāi)展暴露實(shí)驗(yàn),持續(xù)28d,并于0、6h、12h、1d、2d、4d、7d、14d、21d和28d檢測(cè)四種組織中目的基因表達(dá)及肝胰腺中相關(guān)酶的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),四種基因的表達(dá)量在四種組織中隨時(shí)間變化呈現(xiàn)不同規(guī)律。CYP基因可能始終發(fā)揮作用,GST基因在暴露后期被誘導(dǎo);肝胰腺中三種酶活性對(duì)菲敏感,除ERND酶于6h時(shí)外,三種酶在28d中持續(xù)處于高活性狀態(tài),與對(duì)照相比呈顯著差異(P0.05)。(二)(?)暴露對(duì)基因表達(dá)量及其相關(guān)酶活性的影響暴露濃度實(shí)驗(yàn):設(shè)計(jì)10和100μg/L兩個(gè)(?)濃度組及對(duì)照組,暴露持續(xù)28d,并于0、1d、2d、4d、7d、14d、21d和28d取中華絨螯蟹肝胰腺檢測(cè)四種基因表達(dá)量和相關(guān)酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),高濃度(?)對(duì)四種基因的誘導(dǎo)較顯著,CYP2A和CYP4基因自1d起在高濃度中表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P0.05),GST基因也在1-21d時(shí)及CYP2B基因于1-14d時(shí)都顯著高于對(duì)照組(P0.05);此外,CYP2A、CYP2B、GST三種基因在2d時(shí)也被低濃度(?)誘導(dǎo)高表達(dá)(P0.05),CYP2B基因較另兩種基因?qū)Φ蜐舛??)更敏感,于1d時(shí)已呈現(xiàn)高誘導(dǎo)表達(dá)(P0.05);三種酶活性無(wú)論濃度高或低自1d起均被顯著誘導(dǎo),且在1和2d時(shí)低濃度組對(duì)三種酶活的誘導(dǎo)顯著高于高濃度組(P0.05),APND酶在4d、7d、21d和28d時(shí),ERND酶于4d、7d、14d和21d時(shí),以及GST酶于14d、21d和28d時(shí)它們的活性與(?)濃度間具明顯的濃度效應(yīng)(P0.05)。暴露時(shí)間實(shí)驗(yàn):對(duì)高、低兩個(gè)(?)濃度暴露時(shí)間效應(yīng)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),兩個(gè)暴露濃度與中華絨螯蟹肝胰腺中四種基因的表達(dá)量間呈現(xiàn)明顯的時(shí)間效應(yīng),尤其于2d時(shí)四種基因在不同(?)濃度下誘導(dǎo)效應(yīng)均較為明顯(P0.05);CYP2B對(duì)高、低濃度(?)的響應(yīng)速度明顯快于其他三個(gè)基因(P0.05),此外CYP4對(duì)低濃度(?)的響應(yīng)速度也明顯較快,甚至快于對(duì)高濃度(?)(P0.05)。高、低兩個(gè)(?)濃度均對(duì)中華絨螯蟹肝胰腺中三種酶具誘導(dǎo)效應(yīng)和明顯的時(shí)間效應(yīng)(P0.05)。(三)苯并芘暴露對(duì)基因表達(dá)量及其相關(guān)酶活性的影響暴露濃度實(shí)驗(yàn):設(shè)計(jì)兩個(gè)苯并芘濃度組(0.15和0.45μg/L)和對(duì)照組(0μg/L),分別于0、1d、2d、4d、7d、14d、21d和28d取中華絨螯蟹的肝胰腺檢測(cè)目的基因表達(dá)及相關(guān)酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn):高濃度苯并芘對(duì)四種基因的誘導(dǎo)作用明顯;而三種酶的活性無(wú)論苯并芘濃度高或低自2d起均被顯著誘導(dǎo),且在1和2d時(shí)低濃度組對(duì)三種酶的誘導(dǎo)顯著高于高濃度組(P0.05),21d和28d時(shí)的APND酶,4d和28d時(shí)的ERND酶,及4-28d的GST酶的活性與苯并芘濃度間呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)(P0.05)。暴露時(shí)間實(shí)驗(yàn):將處理組與0d作對(duì)照,結(jié)果發(fā)現(xiàn):CYP2A、CYP4和GST三種基因受高濃度苯并芘的誘導(dǎo)表達(dá)明顯,且CYP4基因較另外兩個(gè)基因的響應(yīng)更迅速,高濃度組自1d起即顯著高于0d(P0.05);CYP2B基因?qū)Φ蜐舛缺讲④诺捻憫?yīng)較其他基因敏感。不同時(shí)間點(diǎn)高、低濃度苯并芘對(duì)中華絨螯蟹肝胰腺中的三種酶均呈現(xiàn)誘導(dǎo)效應(yīng),且具明顯的時(shí)間效應(yīng)(P0.05),其中三種酶對(duì)低濃度苯并芘的響應(yīng)速度明顯比對(duì)高濃度苯并芘的快,于1d時(shí)就表現(xiàn)出顯著的活性差異(P0.05),而高濃度苯并芘僅APND酶于1d時(shí)呈現(xiàn)顯著的活性差異(P0.05)。三.毒物暴露對(duì)對(duì)肝組織顯微結(jié)構(gòu)的影響分別取暴露在菲濃度2000μg/L、(?)濃度10和10μg/L、苯并芘濃度0.15和0.45μg/L,及它們的對(duì)照,于0和28d取肝胰腺做石蠟切片,結(jié)果表明,菲、(?)、苯并芘暴露均對(duì)中華絨螯蟹的肝組織造成較為明顯的損傷。綜合以上研究,三種多環(huán)芳烴均可誘導(dǎo)目的基因的表達(dá),并呈現(xiàn)出一定的時(shí)間效應(yīng)和濃度效應(yīng),且對(duì)相關(guān)酶也具有顯著時(shí)間效應(yīng)和濃度效應(yīng),此外在組織層面也會(huì)對(duì)肝胰腺造成損傷。
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：X174;S917.4

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本文編號(hào)：1260477