本文關(guān)鍵詞：茶樹中CsECGT基因的克隆及其功能驗(yàn)證

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【摘要】：酯型兒茶素是簡單兒茶素c環(huán)3位羥基沒食子酰基化的產(chǎn)物。已有資料表明：植物體內(nèi)代謝物質(zhì)的�；窃诨钚怎；w的參與下完成的。目前在植物機(jī)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)有很多種活性�；w,能夠催化物質(zhì)的酰基化,如�；蝓セ衔�(CoA thioesters)、5-O咖啡�？崴�(5-0- caffeoylquinate)、沒食子�；咸烟�(1-O-galloyl-p-D-glucose)表兒茶素沒食子�；D(zhuǎn)移酶(epicatechin:1-O-galloyl-β-D-glucose-O-galloyltransferase ECGT)能夠在植物體外催化簡單兒茶素合成酯型兒茶素。但在茶樹(Camellia sinensis (L.) O. Kuntze)中,證明該反應(yīng)存在的證據(jù)還不清楚。茶樹(Camellia sinensis (L.) O. Kuntze)中存在酯型兒茶素的水解酶。合成與水解反應(yīng)的同時(shí)進(jìn)行,很難判斷ECGT就是茶樹體內(nèi)酯型兒茶素合成的關(guān)鍵酶。本研究通過CsECGT的原核表達(dá)、CsECGT序列分析、過表達(dá)載體的構(gòu)建、ECGT的表達(dá)與提取、ECGT的功能驗(yàn)證等實(shí)驗(yàn),獲得了如下結(jié)果：1.成功構(gòu)建了兩個(gè)CsECGT原核表達(dá)系統(tǒng)：p ET28-ECGT/pET32-ECGT重組大腸桿菌。經(jīng)過一系列的優(yōu)化表達(dá)條件的探索,包括SDS-PAGE蛋白檢測、酶純化手段、生物轉(zhuǎn)化、高效HPLC,都沒有得到顯著的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2.分析了CsECGT的基因序列：全長為1726 bp,其包含一個(gè)完整的編碼區(qū)1443bp,5’非翻譯區(qū)(UTR)72bp,3'非翻譯區(qū)180 bp和polyA尾巴31 bp,編碼區(qū)GC含量為51.83%，，編碼480個(gè)氨基酸組成的蛋白(表兒茶素沒食子�；D(zhuǎn)移酶)。通過blast軟件在線比較分析,發(fā)現(xiàn)CsECGT編碼的氨基酸序列與其它物種的絲氨酸�；D(zhuǎn)移酶(Serine acyltransferase)具有較高的一致性,尤其與來玉米(Zea mays)、潘那利番茄(Solanum pennellii)、蝶豆(Clitoria ternatea)的絲氨酸酰基轉(zhuǎn)移酶的相似性達(dá)40%以上。3.成功構(gòu)建了ECGT過表達(dá)載體pCXSN-ECGT、對(duì)照空載體pCDG-CCDB,并將其轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌GV3101中。4.通過農(nóng)桿菌GV3101介導(dǎo),成功將過表達(dá)載體pCXSN-ECGT、空載體pCDG-CCDB導(dǎo)入到煙草(Nicotiana tabacum L.)鮮葉中。經(jīng)過誘導(dǎo)分化、生根,最終獲得了陽性植株。5.根據(jù)過表達(dá)載體自身序列的特征設(shè)計(jì)了引物HybF(5'-TGTCCTGCGGGTAAATAGC-3')HybR(5'-GTCCATCACAGTTTGCCAGT-3'),成功鑒別了誘導(dǎo)體系的可行性(抗性篩選)；結(jié)合載體表達(dá)的選擇方向性與CsECGT基因的序列特點(diǎn),設(shè)計(jì)引物CXSN-SeqF(5'-CATGCTTAACGTAATTCAACAG-3'). CXSN-SeqR(5'-AATCAAGCATTCTACTTCTATT-3'),驗(yàn)證了陽性結(jié)果。6.提取了陽性煙草(Nicotiana tabacum L.)葉片中的粗酶,進(jìn)行了SDS-PAGE電泳。結(jié)果表明：CsECGT基因在煙草中大量表達(dá),且其片段大小為55 KD。7.用甲醇+甲酸直接提取煙草(Nicotiana tabacum L.)鮮葉物質(zhì),液相檢測結(jié)果表明：一定鮮葉量下的該提取物,沒有觀察到其它兒茶素。用50 mM磷酸緩沖液提取煙草鮮葉里的酶,建立了ECTG酶體外反應(yīng)體系。初步得到了CsECGT基因編碼的酶,對(duì)作用底物EC/EGC具有差異性。
【學(xué)位授予單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S571.1

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1 吳敦超;茶樹中CsECGT基因的克隆及其功能驗(yàn)證[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

本文編號(hào)：1143411