本文關鍵詞：基于DNA甲基化途徑葉酸對阿爾茨海默病模型作用機制的研究

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【摘要】：目的阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的病理特征是細胞外淀粉樣蛋白(amyloid-βpeptide,Aβ)沉積,以及神經細胞內高磷酸化tau蛋白形成神經纖維節(jié)纏結(neurofibrillary tangles,NFTs)。AD的發(fā)生與多種營養(yǎng)素缺乏有關,葉酸作為一碳單位供體參與一碳單位代謝,進而參與體內多種甲基化過程,包括DNA甲基化和蛋白質甲基化等。而一碳單位代謝異�？稍黾硬溉閯游锬X海馬區(qū)Aβ沉積,改變tau蛋白磷酸化水平。異常的DNA和蛋白質甲基化可能是與AD病理機制相關的表觀遺傳學機制。該研究將探討葉酸通過DNA甲基化途徑對AD模型的作用機制,為葉酸防治AD提供科學依據(jù)和新的思路。方法采用三種AD細胞模型和APP/PS1雙轉基因小鼠AD模型研究葉酸對AD模型的作用機制。三種細胞模型分別為穩(wěn)定轉染APP695的小鼠N2a細胞,Aβ低聚物誘導的神經元細胞損傷模型和磷酸酯酶抑制劑誘導損傷的人神經母細胞(SH-SY5Y)瘤模型。分別模擬基因異常以及AD細胞內和細胞外病理機制。體內實驗采用APP/PS1雙轉基因小鼠,對體外實驗結果加以驗證。體外實驗采用不同濃度葉酸(2.8-40μmol/L)孵育N2a-APP細胞96 h,并于細胞中添加甲基轉移酶(DNA methyltransferase,DNMT)阻斷劑,檢測各組細胞甲基化潛能,DNMT活性,APP,PS1和Aβ的表達。不同濃度葉酸干預由Aβ低聚物造成細胞AD樣損傷的原代培養(yǎng)大鼠海馬神經元細胞和小鼠神經元HT-22細胞96 h,檢測各組細胞DNMT活性,APP和PS1的表達,以及細胞活力。不同濃度葉酸(0-40μmol/L)作用于由磷酸酶抑制劑(okadaic acid,OA)(10 nmol/L)孵育的人神經母細胞瘤(human neuroblastoma cells,SH-SY5Y)96 h。檢測葉酸對tau蛋白磷酸化的影響。體內實驗采用七月齡APP/PS1雙轉基因AD小鼠模型檢測葉酸干預后動物腦內Aβ的表達狀況。APP/PS1雙轉基因小鼠飼喂葉酸缺乏飼料或普通飼料,并灌胃葉酸和/或S-腺苷蛋氨酸(s-adenosylmethionine,SAM),采用免疫組化、western blot和RT-pcr法檢測APP,PS1和Aβ的表達;采用高效液相色譜法檢測肝臟組著和腦組織中SAM和SAH的表達;采用焦磷酸測序法檢測APP、PS1基因的甲基化水平。結果葉酸干預N2a-APP細胞實驗結果顯示,葉酸提高APP轉基因細胞甲基化潛能,DNMTs基因和蛋白表達水平及其活性,提高APP和PS1甲基化水平。進而,葉酸降低APP基因表達,PS1基因和蛋白表達,降低Aβ蛋白表達,同時抑制DNMT活性后Aβ蛋白表達增加。葉酸干預神經元細胞的實驗結果顯示,Aβ低聚物降低神經元細胞DNMT活性,增加PS1和APP表達,并降低細胞活力。補充葉酸后神經元細胞甲基化潛能和DNMT活性提高,PS1和APP基因啟動子區(qū)甲基化水平增高,降低PS1和APP表達,并提高細胞活力。而OA孵育的SH-SY5Y細胞tau蛋白Ser396位點高磷酸化,葉酸添加可抑制tau蛋白磷酸化,最大抑制劑量為40μmol/L。葉酸通過抑制去甲基化PP2A降低tau蛋白磷酸化。高葉酸(20和40μmol/L)可增加細胞活力和細胞甲基化潛能。體內實驗結果表明,轉基因小鼠灌胃葉酸60天后,血清葉酸水平明顯升高,但是灌胃SAM不能明顯提高血清葉酸水平。葉酸缺乏可降低動物肝臟中SAM濃度,但對SAH的影響不明顯。灌胃葉酸可提高小鼠腦內DNMT活性,改變APP,PS1基因啟動子區(qū)甲基化水平。葉酸缺乏可增加轉基因小鼠腦內海馬區(qū)APP,PS1和Aβ表達水平,灌胃葉酸可降低上述蛋白表達水平。結論體內、體外研究結果顯示,葉酸對AD的作用機制,一方面可通過提高細胞甲基化潛能和調節(jié)DNMT酶活性,使APP和PS1基因甲基化并靜默,進而減少Aβ蛋白蓄積,抑制Aβ低聚物對神經元細胞的毒性;另一方面葉酸可改變PP2A甲基化,進而影響tau蛋白磷酸化,從而抑制tau蛋白的異常磷酸化。
【關鍵詞】：葉酸 阿爾茨海默病 甲基化 β-淀粉樣蛋白 磷酸化tau蛋白
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R749.16;R-332
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 縮略語/符號說明11-13
• 前言13-20
• 研究現(xiàn)狀、成果13-16
• 研究目的、方法16-20
• 一、葉酸對APP轉基因細胞模型Aβ形成的影響及機制研究20-54
• 1.1 對象和方法20-40
• 1.1.1 實驗材料20-24
• 1.1.2 方法24-40
• 1.1.3 統(tǒng)計分析40
• 1.2 結果40-49
• 1.2.1 葉酸對轉基因細胞Aβ 淀粉樣蛋白產生的影響40-42
• 1.2.2 葉酸對轉基因細胞APP，PS1基因甲基化的影響42-45
• 1.2.3 葉酸對轉基因細胞APP，PS1基因表達的影響45-46
• 1.2.4 葉酸對轉基因細胞DNMTs基因表達及其活性的影響46-49
• 1.2.5 葉酸對轉基因細胞DNA甲基化潛能的影響49
• 1.3 討論49-53
• 1.3.1 葉酸劑量設定的依據(jù)49-50
• 1.3.2 葉酸調節(jié)細胞甲基化潛能和改變細胞DNMT酶活性50-52
• 1.3.3 含有葉酸的復合營養(yǎng)制劑在AD病理過程中的作用52-53
• 1.4 小結53-54
• 二、葉酸對外源性Aβ誘導體外培養(yǎng)神經元細胞損傷的保護作用及機制研究54-74
• 2.1 對象和方法54-59
• 2.1.1 實驗材料54-55
• 2.1.2 方法55-59
• 2.1.3 統(tǒng)計分析59
• 2.2 結果59-70
• 2.2.1 原代細胞鑒定，細胞活力和DNMTs活力59-62
• 2.2.2 葉酸提高外源性Aβ低聚物誘導AD樣損傷神經元細胞APP，PS1基因甲基化水平62-65
• 2.2.3 葉酸降低外源性Aβ低聚物誘導AD樣損傷神經元細胞APP，PS1基因表達65-67
• 2.2.4 葉酸提高外源性 Aβ低聚物誘導 AD 樣損傷神經元細胞 DNMTs 基因表達67-70
• 2.2.5 葉酸提高外源性Aβ低聚物誘導AD樣損傷神經元細胞甲基化潛能70
• 2.3 討論70-73
• 2.3.1 外源性Aβ低聚物可誘發(fā)神經元細胞發(fā)生類AD樣損傷70-73
• 2.3.2 葉酸通過改變基因甲基化水平改善Aβ低聚物引起的神經細胞毒性73
• 2.4 小結73-74
• 三、葉酸對SH-SY5Y細胞高磷酸化tau蛋白形成的影響及機制研究74-87
• 3.1 對象和方法74-76
• 3.1.1 實驗材料74
• 3.1.2 方法74-76
• 3.1.3 統(tǒng)計分析76
• 3.2 結果76-83
• 3.2.1 葉酸對高磷酸化tau蛋白的作用76-77
• 3.2.2 葉酸對PP2Ac蛋白表達及其甲基化的作用77-79
• 3.2.3 葉酸對SH-SY5Y細胞甲基化潛能的作用79-80
• 3.2.4 葉酸對SH-SY5Y細胞活力的作用80
• 3.2.5 tau蛋白磷酸化，PP2a蛋白去甲基化，一碳單位代謝，SH-SY5Y細胞活力和葉酸的關系80-83
• 3.3 討論83-86
• 3.3.1 葉酸調節(jié)PP2A甲基化進而改善tau蛋白高磷酸化83-84
• 3.3.2 PP2Ac啟動子區(qū)的甲基化水平調節(jié)tau蛋白磷酸化84-85
• 3.3.3 葉酸調節(jié)PP2Ac啟動子區(qū)甲基化85-86
• 3.4 小結86-87
• 四、葉酸對雙轉基因小鼠腦內Aβ形成的影響及機制研究87-105
• 4.1 對象和方法87-91
• 4.1.1 實驗材料87-88
• 4.1.2 方法88-91
• 4.1.3 統(tǒng)計分析91
• 4.2 結果91-103
• 4.2.1 動物體重和血清葉酸水平91-92
• 4.2.2 腦組織中APP，PS1基因及蛋白表達水平92-97
• 4.2.3 腦組織中Aβ表達水平97-99
• 4.2.4 腦內APP，PS1基因啟動子區(qū)甲基化水平99-100
• 4.2.5 腦內甲基轉移酶活性100-101
• 4.2.6 肝臟和腦組織中SAM，，SAH表達水平101-103
• 4.3 討論103-104
• 4.3.1 葉酸通過調節(jié)APP，PS1基因甲基化降低轉基因動物腦內Aβ水平103-104
• 4.3.2 葉酸降低轉基因動物腦內Aβ水平的其他可能機制104
• 4.4 小結104-105
• 全文結論105-107
• 論文創(chuàng)新點107-108
• 參考文獻108-118
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明118-120
• 綜述 阿爾茨海默病相關膳食因素研究120-141
• 綜述參考文獻127-141
• 致謝141

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

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本文編號：991014