本文關鍵詞：HLA-G基因修飾及磁靶向趨化BM-MSCs誘導腎移植免疫耐受的研究

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【摘要】：背景腎移植被公認為治療終末期腎病的最佳方式,每年全世界有數(shù)萬計的尿毒癥患者進行腎移植手術。腎移植術后急、慢性排斥反應以及各種原因引起的慢性移植腎病是臨床上制約移植腎長期存活的關鍵因素。目前研究認為誘導機體對于移植腎的免疫耐受是解決上述問題的最理想方式。骨髓間充質干細胞(bone marrow derived mesenchyme stem cells,BM-MSCs)由于具有獨特的免疫調節(jié)作用及多向分化潛能,被認為是誘導免疫耐受、減輕及修復移植腎免疫損傷的理想工具。但是應用到動物模型中后,研究發(fā)現(xiàn)BM-MSCs在體的免疫抑制效應偏弱,在腎移植模型中應用時并不能明顯減少免疫抑制劑的應用。并且由于缺乏向移植腎的靶向機制以及肺、肝等靜脈池的滯留效應,BM-MSCs輸注體內之后,只有極少數(shù)能夠到達移植腎部位,無法在局部發(fā)揮免疫保護、組織修復等效應。因此,迫切需要研究如何提高BM-MSCs本身的免疫抑制效應以及增加在移植腎局部的聚集,以縮小BM-MSCs從基礎研究到腎移植臨床應用的距離。目的本研究擬通過慢病毒載體將具有明確免疫抑制效應的HLA-G基因轉染到BM-MSCs中,觀察能否使其細胞表面大量表達HLA-G分子,并在體外驗證其免疫抑制效應是否得到增強。為使轉染HLA-G后輸注到體內的BM-MSCs能夠聚集在移植腎局部發(fā)揮效應,本研究擬使BM-MSCs吞噬超順磁納米鐵顆粒(Super-paramagnetic iron oxide,SPIO)后帶有磁性,在移植腎局部應用強磁場,觀察能否使BM-MSCs在移植腎局部聚集并發(fā)揮免疫抑制效應。本研究擬為BM-MSCs在腎移植領域的應用提供一種新思路。方法1、穿刺兔股骨獲得骨髓,使用密度梯度離心法分離骨髓單個核細胞。應用貼壁培養(yǎng)法獲得BM-MSCs。誘導向成骨、成脂細胞方向分化。流式細胞術鑒定BM-MSCs表面分子標志。2、化學合成HLA-G基因,PCR擴充,與慢病毒載體一起進行酶切及連接,行Real-time PCR鑒定和測序,構建HLA-G慢病毒表達質粒。轉染293T細胞后收集含病毒上清后濃縮,Real-time PCR測定病毒滴度。攜帶HLA-G的慢病毒載體感染BM-MSCs,觀察綠色熒光表達,獲取最合適的MOI值。WB法檢測細胞膜型HLA-G表達水平。ELISA法檢測上清中分泌型HLA-G水平。3、建立混合淋巴細胞培養(yǎng)體系,通過BM-MSCs與淋巴細胞共培養(yǎng),驗證轉染了HLA-G的BM-MSCs(之后描述為HLA-G-BM-MSCs)的功能學效應特點。應用免疫磁珠從培養(yǎng)體系中分離出CD4+T細胞,檢測其凋亡情況,并通過WB法檢測其細胞周期相關蛋白的表達。4、應用SPIO孵育HLA-G-BM-MSCs,使其帶有磁性。建立兔同種異體腎移植模型,在移植腎部位安放體外強磁場,形成磁場的趨化。將吞噬了SPIO的BM-MSCs輸注體內,病理切片觀察BM-MSCs能否更多地聚集到移植腎。觀察與環(huán)孢素相比,其免疫抑制效應如何。結果1、密度梯度離心及貼壁培養(yǎng)法成功分離培養(yǎng)出兔BM-MSCs。細胞生長旺盛,可連續(xù)傳代15次以上,形態(tài)呈典型梭狀,漩渦狀生長。在成骨、成脂誘導下,能夠成功分化為成骨及成脂細胞。流式細胞BM-MSCs表面抗原示CD90表達陽性,CD14表達陰性。2、成功構建攜帶HLA-G基因的慢病毒轉染體系,病毒滴度達到2x109TU/ml。攜帶HLA-G的慢病毒成功感染BM-MSCs,確定最佳MOI值為50。轉染后綠色熒光表達強,傳代10次以上仍然可以穩(wěn)定表達綠色熒光。WB顯示BM-MSCs大量表達HLA-G分子。ELISA法顯示BM-MSCs并不產(chǎn)生分泌型的HLA-G。3、成功建立兔BM-MSCs與人PBMC的Transwell共培養(yǎng)體系。結果顯示HLA-G-BM-MSCs能夠明顯抑制淋巴細胞增殖反應,抑制率達到61.2%。這種抑制效應是在與淋巴細胞發(fā)生接觸時產(chǎn)生的,Transwell上室中未與HLA-G-BM-MSCs發(fā)生接觸的淋巴細胞增殖不受抑制。凋亡檢測顯示共培養(yǎng)體系中的CD4+T細胞并沒有出現(xiàn)明顯凋亡,而是停留在G0/G1期,未能進入增殖期,WB檢測顯示相關的細胞周期蛋白cyclin D2、cyclin D3以及CDK等表達明顯減少。4、成功使HLA-G-BM-MSCs吞噬SPIO,吞噬后細胞形態(tài)、增殖能力等不受影響。電鏡顯示細胞內溶酶體中大量鐵顆粒存在。熒光顯微鏡示發(fā)綠色熒光的BM-MSCs內部含有大量紅色熒光的SPIO顆粒。在體外BM-MSCs能夠在強磁場中發(fā)生定向運動。輸注體內之后,應用移植腎局部的外在強磁場能夠使更多的BM-MSCs聚集到腎臟部位。其免疫抑制效應明顯增強,稍弱于環(huán)孢素應用的效果,但是明顯強于不施加磁靶向的組別。結論1、密度梯度離心加貼壁培養(yǎng)法獲得兔BM-MSCs,經(jīng)分化鑒定及流式鑒定符合BM-MSCs標準。2、應用慢病毒載體將HLA-G基因轉染至BM-MSCs細胞,HLA-G基因能夠正確、穩(wěn)定地轉錄和表達。3、體外實驗中,HLA-G-BM-MSCs能夠通過與淋巴細胞的直接接觸抑制其增殖。其抑制CD4+T細胞增殖的機制不是誘導其發(fā)生凋亡,而是通過抑制相關細胞周期蛋白cyclin D2、D3及相關激酶CDK4、6的表達實現(xiàn)的。4、在體實驗中,磁靶向能夠使孵育了SPIO的HLA-G-BM-MSCs更多地聚集到移植腎,使其免疫抑制效應明顯增強,從而減輕移植腎的免疫損傷,促進腎移植術后功能恢復。
【關鍵詞】：骨髓間充質干細胞 HLA-G 慢病毒 混合淋巴細胞培養(yǎng) 細胞周期 超順磁納米鐵顆粒 磁靶向 腎移植
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R699.2
【目錄】：

• 縮略詞表5-6
• 英文摘要6-10
• 中文摘要10-13
• 第一章 前言13-15
• 第二章 兔骨髓來源間充質干細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定15-23
• 2.1 材料與方法15-18
• 2.2 結果18-21
• 2.3 討論21-22
• 2.4 小結22-23
• 第三章 HLA-G基因慢病毒轉染體系建立及轉染兔BM-MSCs23-49
• 3.1 材料與方法23-40
• 3.2 結果40-46
• 3.3 討論46-48
• 3.4 小結48-49
• 第四章 過表達HLA-G兔BM-MSCs體外抑制人T淋巴細胞增殖的機制研究49-65
• 4.1 材料與方法49-60
• 4.2 結果60-63
• 4.3 討論63-64
• 4.4 小結64-65
• 第五章 磁靶向兔BM-MSCs誘導腎移植免疫耐受的實驗研究65-84
• 5.1 材料與方法65-70
• 5.2 結果70-81
• 5.3 討論81-83
• 5.4 小結83-84
• 全文結論84-85
• 參考文獻85-88
• 文獻綜述一 HLA-G分子的免疫抑制效應及其在器官移植領域的應用88-100
• 參考文獻95-100
• 文獻綜述二 超順磁納米鐵顆粒在細胞示蹤中的研究現(xiàn)狀及臨床應用前景100-114
• 參考文獻105-114
• 攻讀期間發(fā)表的論著114-115
• 致謝115

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 葉芳;喬振華;朱鐳;楊濤;楊林花;;間充質干細胞對活化T淋巴細胞的免疫調節(jié)作用[J];中國實驗血液學雜志;2008年05期

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本文編號：852467